兒童惡性血液病血清蛋白質組學研究及生物信息學分析.pdf

1、第一部分應用iTRAQ技術聯(lián)合2D LC-MS/MS篩選兒童惡性血液病血清蛋白質標志物
　　背景與目的:惡性血液病是兒童時期常見的惡性腫瘤，目前其診斷主要依靠骨髓或淋巴結穿刺活檢，但因其損傷較大致使患兒依從性差;近年來隨著合理規(guī)范化療及治療策略的不斷創(chuàng)新，惡性血液病的預后有了很大改善，然而仍有一部分患兒難以達到完全緩解或復發(fā)，并且傳統(tǒng)的化療藥物毒副作用大造成化療相關性死亡率高，因此惡性血液病急需尋找非侵襲性和特異性的早期診斷標志物

2、和治療靶點。同位素標記的相對和絕對定量(iTRAQ)標記的二維液相色譜串聯(lián)質譜(2DLC-MS/MS）聯(lián)合生物信息分析軟件系統(tǒng)(IPA)的使用，是尋找差異蛋白、篩選蛋白分子標志物的理想工具。本研究聯(lián)合iTRAQ-2DLC-MS/MS與IPA技術篩選兒童惡性血液病的血清差異表達蛋白，探討惡性血液病診斷、治療的新靶點以及可能的發(fā)病機制。
　　方法:
　　1.分別收集兒童初治急性B淋巴細胞白血病(B-ALL)、急性T淋巴細胞白血病

3、(T-ALL)、急性粒細胞白血病部分分化型(M2)、急性早幼粒細胞白血病(M3)、急性單核細胞白血病（M5）、B細胞性非霍奇金淋巴瘤（B-NHL），T細胞性非霍奇金淋巴瘤（T-NHL）血清各20例作為實驗組，收集同期體檢正常兒童血清20例作為對照組。等量混合各組血清標本，提取蛋白后應用多重親和去除系統(tǒng)(MARS)去除血清中14種高豐度蛋白，超濾除鹽后采用Bradford法測定總蛋白濃度。
　　2.應用iTRAQ試劑標記經胰酶消化后

4、的肽段，113標記正常兒童對照組，114標記B-ALL組，115標記T-ALL組，116標記M2組，117標記M3組，118標記M5組，119標記B-NHL組，121標記T-NHL組。將標記后的肽段混合，運用二維高效反相液相色譜進行分離，然后串聯(lián)質譜對樣品進行分析鑒定。
　　3.根據(jù)所鑒定出蛋白質的iTRAQ相對定量值，通過對兒童惡性血液病各組與正常對照組的蛋白表達量分別進行比較，篩選出差異倍數(shù)在1.2倍以上（上調或下調）的差異蛋

5、白。
　　4.應用生物信息學軟件IPA分別分析惡性血液病各組與正常對照組的差異表達蛋白，獲得各組差異蛋白的生物功能以及參與的信號通路和蛋白間相互作用網絡;查閱差異蛋白相關文獻并根據(jù)IPA分析結果初步篩選出有意義的血清差異表達蛋白。
　　5.采用ELISA雙抗夾心法分別檢測了50例B-ALL、20例T-ALL、20例M2、20例M3、20例M5、20例B-NHL、20例T-NHL和30例正常兒童對照組的血清LRG1、S100A

6、8和SPARC表達水平，并計算其統(tǒng)計學意義來驗證質譜的準確性，進一步篩選與兒童惡性血液病相關的生物標記物。
　　結果:
　　1.應用iTRAQ-2DLC-MS/MS技術，比較兒童惡性血液病各組和對照組血清差異蛋白，篩查與惡性血液病相關的血清標志物。質譜鑒定總共得到534個非冗余蛋白質，以正常兒童對照組蛋白質作為對照，分別計算各組表達值與正常對照組比值，設定其比值＞1.2或＜0.8（即差異倍數(shù)＞1.2且P＜0.05）為明顯上調

7、或下調蛋白，即各組有意義的血清差異表達蛋白。
　　2.兒童惡性血液病各組的差異蛋白及其相關信號通路與關聯(lián)蛋白相互作用網絡
　　(1)B-ALL組的血清差異蛋白共有81個，其中上調20個，下調61個;經IPA軟件分析顯示這些差異蛋白主要分布在與細胞信號轉導和交互(Cell-To-CellSignaling and Interaction)、組織發(fā)育(Tissue Development)、細胞運動(CellularMoveme

8、nt)、免疫細胞運輸（Immune Cell Trafficking）、心血管疾病(Cardiovascular Disease)、血液系統(tǒng)的發(fā)育和功能(Hematological SystemDevelopment and Function)等相關的功能中;而參與的主要信號通路包括Acute Phase Response Signaling、 LXR/RXR Activation、Coagulation System、Intrinsi

9、c Prothrombin Activation Pathway、 Atherosclerosis Signaling以及Extrinsic Prothrombin Activation Pathway通路等;差異蛋白共參與4個主要的蛋白相互作用網絡（參與網絡的目的差異蛋白超過9個）。
　　(2)T-ALL組的血清差異蛋白共有85個，其中上調43個，下調42個;經IPA軟件分析顯示這些差異蛋白主要分布在與Cell-To-Cell

10、Signaling andInteraction、Tissue Development、Cellular Movement、Immune Cell Trafficking、Cardiovascular Disease、Hematological System Development and Function等相關的功能中;而參與的主要信號通路包括Acute Phase Response Signaling、LXR/RXR Activat

11、ion、 Atherosclerosis Signaling、 Clathrin-mediatedEndocytosis Signaling、 Production of Nitric Oxide and Reactive OxygenSpecies in Macrophages、IL-12 Signaling and Production in Macrophages、Agranulocyte Adhesion and Diapede

12、sis通路等;此外差異蛋白共參與6個主要的蛋白相互作用網絡（參與網絡的目的蛋白超過9個）。
　　(3)M2組的血清差異蛋白共有91個，其中上調27個，下調64個;經IPA軟件分析顯示這些差異蛋白主要分布在與Cellular Movement、Immune CellTrafficking、 Cardiovascular Disease、Cell-To-Cell Signaling and Interaction、Tissue Dev

13、elopment、Organismal Injury and Abnormalities、HematologicalSystem Development and Function、Hematological Disease等相關的功能中;而參與的主要信號通路包括LXR/RXR Activation、 Acute Phase Response Signaling、 Coagulation System、 Atherosclerosis S

14、ignaling、 Intrinsic ProthrombinActivation Pathway、 Clathrin-mediated EndocytosisSignaling、 IL-12 Signalingand Production in Macrophages、 Production of Nitric Oxide and ReactiveOxygen Species in Macrophages通路等;此外差異蛋白共參與5個

15、主要的蛋白相互作用網絡（參與網絡的目的蛋白超過9個）。
　　(4) M3組的血清差異蛋白共有83個，其中上調33個，下調50個;經IPA軟件分析顯示這些差異蛋白主要分布在與Cellular Movement、 Immune CellTrafficking、 Hematological System Development and Function、 Cell-To-CellSignaling and Interaction、 Ti

16、ssue Development、 Cardiovascular Disease、Inflammatory Response等相關的功能中;而參與的主要信號通路包括LXR/RXR Activation、 Acute Phase Response Signaling、 AtherosclerosisSignaling、 Complement System、 Production of Nitric Oxide and ReactiveOx

17、ygen Species in Macrophages、 IL-12 Signaling and Production inMacrophages通路等;此外差異蛋白共參與5個主要的蛋白相互作用網絡（參與網絡的目的蛋白超過11個）。
　　(5) M5組的血清差異蛋白共有84個，其中上調26個，下調58個;經IPA軟件分析顯示這些差異蛋白主要分布在與Cardiovascular Disease、 Cell-To-CellSignal

18、ing and Interaction、 Tissue Development、 Metabolic Disease、Hematological Disease、 Hematological System Development and Function、Organismal Functions、 Immune Cell Trafficking等相關的功能中;而參與的主要信號通路包括Acute Phase Response Signal

19、ing、 LXR/RXR Activation、Complement System、 Atherosclerosis Signaling、 CoagulationSystem、 IL-12Signaling and Production in Macrophages、 Production of Nitric Oxide andReactive Oxygen Species in Macrophages通路等;此外差異蛋白共參與5個主要

20、的蛋白相互作用網絡（參與網絡的目的蛋白超過11個）。
　　(6) B-NHL組的血清差異蛋白共有79個，其中上調34個，下調45個;經IPA軟件分析顯示這些差異蛋白主要分布在與Cell-To-Cell Signaling and Interaction、Tissue Development、 Metabolic Disease、 Cellular Movement、 Immune CellTrafficking、 Hematolo

21、gical System Development and Function等相關的功能中;而參與的主要信號通路包括Acute Phase Response Signaling、 LXR/RXRActivation、 Intrinsic Prothrombin Activation Pathway、 CoagulationSystem、 Extrinsic Prothrombin Activation Pathway、Atheroscle

22、rosis Signaling通路等;此外差異蛋白共參與4個主要的蛋白相互作用網絡（參與網絡的目的蛋白超過11個）。
　　(7) T-NHL組的血清差異蛋白共有73個，其中上調45個，下調28個;經IPA軟件分析顯示這些差異蛋白主要分布在與Organismal Injury and Abnormalities、Metabolic Disease、 Cardiovascular Disease、 Cell-To-Cell Signa

23、ling andInteraction、Tissue Development、Cellular Movement、Hematological SystemDevelopment and Function、Immune Cell Trafficking等相關的功能中;而參與的主要信號通路包括Acute Phase Response Signaling、 LXR/RXR Activation、Atherosclerosis Signalin

24、g、Production of Nitric Oxide and Reactive OxygenSpecies in Macrophages、 Clathrin-mediated EndocytosisSignaling、 IL-12Signaling and Production in Macrophages通路等;此外差異蛋白共參與4個主要的蛋白相互作用網絡（參與網絡的目的蛋白超過11個）。
　　3.ELISA檢測結果顯示血清

25、LRG1、S100A8和SPARC蛋白的表達情況與iTRAQ結果一致。ELISA結果驗證了LRG1和S100A8在兒童惡性血液病血清中表達上調;SPARC蛋白在兒童急性白血病(Acute Leukemia)血清中表達水平下調，而在兒童NHL血清中無變化。
　　結論:
　　1.本研究首次應用iTRAQ-2DLC-MS/MS聯(lián)合IPA技術篩選兒童惡性血液病血清的蛋白分子標志物，具有較高的重復性和精確性，共鑒定到534個非冗余蛋白

26、質。得到了大量可靠的差異蛋白質信息，B-ALL組的差異蛋白共有81個，其中上調20個，下調61個;T-ALL組的血清差異蛋白85個，其中上調43個，下調42個;M2組的血清差異蛋白91個，其中其中上調27個，下調64個;M3組的血清差異蛋白83個，其中上調33個，下調50個;M5組的血清差異蛋白84個，其中其中上調26個，下調58個;B-NHL組的血清差異蛋白79個，其中上調34個，下調45個;T-NHL組的血清差異蛋白73個，其中上調

27、45個，下調28個;為兒童惡性血液病早期診斷提供非侵襲性的手段及治療提供潛在的靶點，并為進一步研究兒童惡性血液病可能的發(fā)病分子機制提供實驗基礎。
　　2.采用IPA生物信息學方法對差異表達蛋白質的生物學功能及其涉及的信號通路進行分析，功能分析發(fā)現(xiàn)差異蛋白主要集中于細胞間信號轉導與相互作用、血液系統(tǒng)的發(fā)育和功能、組織發(fā)育、細胞運動、免疫細胞運輸?shù)?進行IPA通路分析，發(fā)現(xiàn)大部分差異蛋白集中于Acute Phase Response

28、Signaling、LXR/RXR Activation、 Atherosclerosis Signaling、 IL-12 Signaling andProduction in Macrophages四個通路，為兒童惡性血液病發(fā)病機制提供了研究線索。
　　3.采用ELISA對3個候選蛋白LRG1、S100A8和SPARC在血清中的表達進行了驗證，結果與質譜鑒定結果一致。其中S100A8和LRG1在兒童惡性血液病中表達上調，SPA

29、RC在兒童AL中表達下調，提示S100A8、LRG1可能與兒童惡性血液病發(fā)病有關，SPARC可能與AL發(fā)病有關，可作為潛在的分子標志物和治療靶點，并需要在臨床中進行廣泛的驗證。
　　4.SPARC可作為鑒別兒童AL與NHL的蛋白標志物。
　　第二部分應用SERPA技術篩選兒童急性B淋巴細胞白血病相關抗原及自身抗體
　　背景與目的:急性淋巴細胞白血病（ALL）是兒童時期最常見的血液系統(tǒng)惡性腫瘤，約占15歲以下兒童惡性腫瘤

30、發(fā)病率的25％，其中最常見的類型為急性B淋巴細胞白血病(B-ALL)。目前其診斷主要依靠骨髓穿刺，但因損傷較大患兒依從性差;近年來由于聯(lián)合化療和支持治療的不斷完善，兒童ALL的預后有了很大改善，但ALL的發(fā)病機制至今不清;化療難以根除微小殘留病變獲得長期緩解，仍有約20％的ALL患兒復發(fā)，復發(fā)后再次化療常常無效，并且傳統(tǒng)的化療藥物對白血病細胞的殺傷作用是非特異性的，其在殺傷白血病細胞的同時也殺傷正常的造血細胞，產生嚴重的中性粒細胞缺乏和

31、血小板減少等造成化療相關性死亡。因此，應用靶向治療方法特異性地殺滅白血病細胞是目前急需解決的問題。越來越多的證據(jù)表明在白血病患者體內存在著特異性免疫反應，雖然白血病發(fā)病初期血清中的許多抗原由于表達豐度很低不易檢測，但機體免疫系統(tǒng)已經能夠監(jiān)測到這些抗原的存在，并產生大量針對該抗原的特異性自身抗體。血清蛋白質組學分析(SERRA)是將蛋白質組學技術與免疫學技術相結合的一種高通量篩選腫瘤相關抗原及自身抗體的新技術，本研究應用SERRA技術以人

32、B-ALL細胞株NALM-6、REH及BALL-1的總蛋白作為腫瘤抗原來篩選兒童B-ALL相關抗原及自身抗體，為兒童B-ALL的早期診斷及治療奠定基礎。
　　方法:
　　1.首先提取人B-ALL細胞株NALM-6、REH及BALL-1的總蛋白等量混合作為B-ALL抗原來源，再應用雙向電泳(2-DE)根據(jù)蛋白質等電點、分子量的不同對總蛋白進行分離，獲得3張相同的凝膠，其中一塊2-DE凝膠經考馬斯亮藍染色作為平行膠，其余兩塊凝膠

33、經電轉印將凝膠中的蛋白質轉膜，然后分別與B-ALL患兒血清及正常兒童對照血清進行免疫印跡（Western Blot），獲得免疫印跡反應圖譜。經計算機圖像分析，通過匹配免疫印跡圖譜與2-DE凝膠圖譜進而識別差異反應的蛋白點（與B-ALL血清反應陽性而與正常兒童血清反應陰性的點），然后在平行的2-DE凝膠上找到與Western Blot中差異反應蛋白質點相匹配的蛋白質點，再對這些差異蛋白進行胰酶酶切及MALDI-TOF/TOF-MS/MS質

34、譜鑒定，從而確定在血清中存在自身抗體的相關抗原，實驗重復3次。
　　2.為進一步驗證篩選得到的B-ALL相關抗原的自身抗體特異性，采用間接ELISA方法檢測其中兩個蛋白質α-烯醇化酶(ENO1)與電壓依賴性陰離子通道蛋白1(VDAC1)的自身抗體在30例B-ALL患兒、30例其他腫瘤患兒及25例正常兒童血清中的陽性率。
　　3.采用免疫組織化學方法比較ENO1與VDAC1在兒童B-ALL骨髓與正常兒童骨髓中的表達差異。

35、>　　4.應用Western Blot檢測ENO1與VDAC1在三株B-ALL細胞株NALM-6、REH及BALL-1的表達差異。
　　結果:
　　1.應用SERRA技術，在B-ALL細胞株平行膠上篩選出6個差異反應蛋白點（與B-ALL兒童血清反應陽性而與正常兒童血清反應陰性的點），通過質譜鑒定和查詢數(shù)據(jù)庫，6個蛋白點分別鑒定為線粒體順烏頭酸酶(aconitase)、凋亡誘導因子(AIF)、二氫硫辛酰胺脫氫酶(DLD)、EN

36、O1、中鏈脂酰基輔酶A脫氫酶(MCAD)、VDAC1。
　　2.ELISA結果顯示ENO1與VDAC1的自身抗體在B-ALL兒童血清中的陽性率分別為27％和23％，明顯高于正常兒童（4％和0），但不高于其他腫瘤患者(23％和17％)。
　　3.免疫組織化學結果顯示ENO1與VDAC1在兒童B-ALL骨髓均明顯高于正常兒童骨髓中的表達。
　　4.Western Blot檢測結果發(fā)現(xiàn)ENO1與VDAC1蛋白表達水平在三株B