青蒿琥酯抑制人結(jié)腸癌細(xì)胞的生長(zhǎng)及其機(jī)制的初步研究.pdf

1、青蒿素是從黃花蒿中提取的有效抗瘧成分，臨床上用于治療惡性瘧和腦型瘧。青蒿琥酯(ART)是其具有過(guò)氧化橋的倍半萜內(nèi)酯類衍生物，具有水溶性好、抗瘧活性高等特點(diǎn)。近年來(lái)，有人報(bào)道青蒿琥酯具有體內(nèi)外抗腫瘤作用。目前實(shí)驗(yàn)已經(jīng)證實(shí)青蒿琥酯對(duì)腫瘤細(xì)胞有抑制作用，可以殺傷腫瘤細(xì)胞，并且與傳統(tǒng)化療藥不存在交叉耐藥。但是具體抗癌機(jī)制不明，進(jìn)一步研究其抗癌機(jī)制，有助為臨床抗癌藥物開發(fā)打下基礎(chǔ)。 本研究選擇人結(jié)腸癌高轉(zhuǎn)移細(xì)胞株SW620和低轉(zhuǎn)移細(xì)胞株S

2、W480作為對(duì)象，應(yīng)用MTT法檢測(cè)青蒿琥酯對(duì)細(xì)胞增殖活性的影響；采用流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定結(jié)腸癌細(xì)胞的凋亡；并且用RT-PCR技術(shù)對(duì)青蒿琥酯作用SW620細(xì)胞前后VEGF的mRNA的改變作了研究。初步探討了青蒿琥酯對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞株的體外抑制作用及其抗腫瘤的機(jī)制。 實(shí)驗(yàn)方法: 1.細(xì)胞培養(yǎng)及增殖能力檢測(cè) 細(xì)胞株SW480和SW620在37℃、含5％C02、飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞接種于96孔培養(yǎng)板中，培養(yǎng)24

3、h后加入適當(dāng)濃度藥物，使終濃度分別為10、20、40、60、90μg/ml。分別培養(yǎng)24、48h，在酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀上測(cè)定各孔光吸收值(OD值)，以O(shè)D值表示結(jié)腸癌細(xì)胞增殖程度并計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率。 2.流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定各處理組的細(xì)胞凋亡率 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SW480和SW620細(xì)胞，20、40μg/mlART作用細(xì)胞48h，正常生長(zhǎng)的細(xì)胞作為對(duì)照。分別收集各組細(xì)胞(大于106)，加冷70％乙醇固定，4℃過(guò)夜。分別加入碘化丙錠

4、(PI)染色液，1h后流式細(xì)胞儀檢測(cè)。CellQuest軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。 3.RT-PCR檢測(cè)ART對(duì)結(jié)腸癌SW620細(xì)胞的VEGFmRNA表達(dá)的影響 選取VEGF高表達(dá)的SW620細(xì)胞作為研究對(duì)象，ART作用48小時(shí)后按Trizol試劑盒說(shuō)明一步法提取總RNA，用紫外線分光光度計(jì)測(cè)定RNA的純度并定量。取總RNA行逆轉(zhuǎn)錄，然后再進(jìn)行PCR反應(yīng)，反應(yīng)產(chǎn)物在1.5％瓊脂糖凝膠上電泳，應(yīng)用凝膠掃描儀分析電泳帶的光密度，并以

5、β-actin校正做相對(duì)量分析，數(shù)值以兩者的相對(duì)光密度比值表示。 4.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 所有定量分析實(shí)驗(yàn)均重復(fù)三次，用SPSS13.0forWindows統(tǒng)計(jì)軟件包統(tǒng)計(jì)分析，P＜0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果： 1.不同濃度的青蒿琥酯對(duì)人SW480和SW620細(xì)胞株的增殖都具有明顯抑制作用，隨著作用時(shí)間的延長(zhǎng)，藥物濃度的增加，其抑制作用也增加。 2.經(jīng)流式細(xì)胞儀分析青蒿琥酯處理后的結(jié)腸癌細(xì)胞，

6、熒光直方圖中顯示各藥物濃度作用的SW480和SW620細(xì)胞Go/G1期峰前均出現(xiàn)亞二倍體峰，藥物處理組比對(duì)照組的凋亡率升高，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。20μg/ml、40μg/ml的ART作用于SW480和SW620細(xì)胞48h后，細(xì)胞凋亡率分別為8.6±1.09％、11.49±0.61％和6.16±0.57％、13.08±1.06％。而對(duì)照組SW480和SW620細(xì)胞的凋亡率只有0.47±0.02％和0.86±0.06％。 3.RT-PCR