新生豬Sertoli細胞在胰島移植中的免疫保護作用及其免疫豁免機制研究.pdf

1、本研究分為四部分：
　　 第一部分：新生豬Sertoli細胞在Wistar大鼠腎包膜下存活的實驗研究
　　 目的：在不使用任何免疫抑制劑和不進行任何免疫保護干預的措施下，探討新生豬Sertoli細胞（NPSCs）在Wistar大鼠腎包膜下的生存狀態(tài)并初步研究其自身免疫豁免機制，為NPSCs與胰島細胞共同移植的應用奠定理論基礎。
　　 方法：體外分離培養(yǎng)10～15日齡的湖北白豬睪丸Sertoli細胞即NPSCs；該

2、細胞體外培養(yǎng)3天后，應用RT-PCR檢測Sox9和FasL的表達；同時將1.5×106個NPSCs移植入正常Wistar大鼠左腎包膜下，術后分別在第3、7、14、21和40天切取Wistar大鼠左側腎臟，采用RT-PCR和免疫組化染色檢測腎包膜下移植的NPSCs特異性標記Sox9的表達。
　　 結果：每個新生豬睪丸可以獲得5.68±1.75×107個NPSCs，占培養(yǎng)細胞總數的90%左右，活性達95%；體外分離培養(yǎng)的NPSCs能

3、夠穩(wěn)定表達其特異性標記因子Sox9，但FasL 幾乎不表達。1.5×106個NPSCs 移植入Wistar 大鼠左腎包膜下第3、7、14和21天后，RT-PCR 證實腎包膜下的移植物內有大量豬Sox9表達，Sox9免疫組化染色亦表明腎包膜下有成團聚集的Sox9陽性細胞；但是移植后第40天時，RT-PCR 證實腎包膜下移植物內的豬Sox9表達明顯減弱，同時免疫組化表明成團聚集的Sox9 陽性細胞團明顯減少，NPSCs 僅散在存在。

4、　　 結論：在不使用任何免疫抑制劑和不進行任何免疫保護干預的措施下，NPSCs在Wistar大鼠腎包膜下可以存活21天以上，但移植后40天時存活的NPSCs數量明顯減少，其免疫豁免機制與FasL的作用無關。
　　 第二部分：SD大鼠胰島分離純化及Wistar大鼠化學性糖尿病模型的建立
　　 目的：優(yōu)化Shapiro的胰島細胞分離方法，分離純化Sprague Dawley（SD）大鼠胰島細胞；建立Wistar大鼠化學性糖

5、尿病模型，為胰島細胞移植研究奠定技術支持。
　　 方法：采用含7.5mmol/LCa2+的1mg/ml的V型膠原酶胰管逆行灌注胰腺、37℃靜止消化，F(xiàn)icoll 400不連續(xù)密度梯度離心純化的方法，分離培養(yǎng)SD大鼠胰島細胞；培養(yǎng)的胰島細胞經雙硫腙（dithizon，DTZ）染色鑒定，ELISA葡萄糖刺激實驗檢測分離培養(yǎng)的胰島細胞功能；200mg/kg的四氧嘧啶一次性腹腔注射誘導Wistar大鼠化學性糖尿病模型，連續(xù)兩次非空腹血糖

6、≥22mmol/L視為造模成功。
　　 結果：每只大鼠可獲得520±30個胰島當量（islets equivalent quantity，IEQ）的胰島細胞，DTZ 染色鑒定后見胰島細胞純度達80%，手檢后純度達90%以上；Wistar大鼠腹腔注射四氧嘧啶后，第3和7天非空腹血糖均大于22mmol/L，并且出現(xiàn)多飲、多尿、體重下降等糖尿病癥狀，造模成功率達85%。
　　 結論：經優(yōu)化后的分離方法更加簡捷并獲得了純度較高、

7、大量的大鼠胰島細胞；通過單次腹腔注射四氧嘧啶能夠穩(wěn)定、高效的誘導大鼠化學性糖尿病模型。
　　 第三部分：聯(lián)合移植異種新生豬Sertoli細胞延長大鼠同種異體胰島移植存活
　　 目的：探討異種NPSCs在大鼠同種異體胰島細胞移植中的免疫保護作用及潛在的免疫豁免機制，為NPSCs在臨床同種異體胰島移植的應用奠定理論基礎。
　　 方法：在上述第一、二部分的實驗基礎上，建立SD大鼠→Wistar糖尿病受鼠的同種異體胰島移

8、植模型。實驗分組如下：①單純胰島細胞移植組（n=8），1500 IEQ的SD大鼠胰島細胞移植入Wistar糖尿病大鼠左腎包膜下；②小量NPSCs與胰島細胞同側移植組（n=8），1.5×106個NPSCs與1500 IEQ的SD大鼠胰島細胞共同移植入糖尿病Wistar大鼠左腎包膜下；③大量NPSCs與胰島細胞同側移植組（n=8），1.0×107個NPSCs與1500 IEQ的SD大鼠胰島細胞共同移植入糖尿病Wistar大鼠左腎包膜下；④大

9、量NPSCs與胰島細胞分側移植組（n=5），1.0×107個NPSCs移植入Wistar糖尿病大鼠右腎包膜下，同時將1500 IEQ的SD大鼠胰島細胞移植入另一側左腎包膜下；術后觀察Wistar糖尿病大鼠血糖變化，血糖連續(xù)2次≥11.2mmol/L時視為胰島細胞發(fā)生排斥；術后7天或移植物發(fā)生排斥時，免疫病理學比較腎包膜下淋巴細胞浸潤情況并檢測胰島細胞特異性標記物Insulin、NPSCs特異性標記因子Sox9和保護性基因Bcl-2、HO

10、-1的表達。
　　 結果：1.5×106個NPSCs與1500 IEQ胰島細胞共同移植入受鼠左腎包膜后，胰島移植物平均存活時間僅稍微延長到8.33±0.58天；當同側共同移植的NPSCs增加到1.0×107個時，胰島移植物平均存活時間顯著延長到16.33±1.53天，與單純胰島移植組（5.67±0.94天）相比，差異有顯著意義（P<0.01）；但是將1.0×107個NPSCs移植入受體鼠右腎包膜，同時將1500 IEQ胰島細胞移

11、植入另一側即左腎包膜后，胰島移植物平均存活時間未見明顯延長（5.25±0.25天），與單純胰島移植組相比差異無顯著意義（P>0.05）。大量NPSCs與胰島細胞同側移植組在移植術后7天，與單純胰島移植組相比，免疫組化可見，腎包膜炎癥反應輕微，淋巴細胞散在浸潤且局限在腎包膜下，包膜內可見呈團塊狀排列的細胞團，經Sox9免疫組化染色證實該細胞團即為移植的NPSCs；Insulin染色可見腎包膜下有大量的胰島細胞存在；此外免疫組化還證實，大量

12、NPSCs組腎包膜下有大量Bcl-2保護性基因的表達，但HO-1在各組間均有表達。
　　 結論：足量NPSCs對共同移植的大鼠胰島細胞具有局部的免疫學保護作用，并顯著延長大鼠胰島細胞在同種異體腎包膜下的存活時間；其機制可能與NPSCs 在局部誘導保護性基因Bcl-2表達上調有關，而與FasL的作用無關。NPSCs和胰島細胞不同部位移植則無保護作用。
　　 第四部分：新生豬Sertoli細胞抵御正常人血清中天然抗體介導的補

13、體殺傷作用
　　 目的：探討異種NPSCs 抵御人血清中天然抗體介導的補體殺傷作用及其主要機制，為NPSCs與胰島細胞聯(lián)合移植的臨床應用奠定理論基礎。
　　 方法：以永生化豬血管內皮細胞系（SV40-PED）作為對照，F(xiàn)ITC-GS-IB4 lectin 染色流式細胞儀（FACS）及免疫熒光檢測并比較NPSCs與SV40-PED天然抗原α-Gal的表達；FACS檢測并比較2種細胞分別與正常人血清（normal human

14、 serum，NHS）中天然抗體IgM、IgG的結合情況；乳酸脫氫酶釋放試驗（LDH法）檢測20%NHS對NPSCs及SV40-PED細胞的殺傷；MTT法檢測兩種細胞在20%NHS中培養(yǎng)時的活性；細胞免疫熒光檢測補體C3c、C4d在NPSCs、SV40-PED的沉積；細胞免疫組化及免疫熒光檢測補體攻膜復合物C5b-9在2種細胞上的沉積。Western blot檢測并比較2種細胞clusterin的表達；RT-PCR檢測并比較兩種細胞補體

15、調節(jié)蛋白CD46、CD59的表達。
　　 結果：NPSCs能夠表達α-Gal，但明顯弱于SV40-PED（平均熒光強度分別為41.78±2.39和95.17±2.39，P<0.05）；NPSCs雖可與人血清中天然抗體IgG、IgM結合，但其結合程度明顯弱于SV40-PED；20%NHS對NPSCs、SV40-PED的殺傷率分別為24.38%±0.50%和53.13%±14.53%（P<0.01）；2種細胞在20%NHS中的活性分

16、別為：98.73%±18.84%和52.43%±8.08%（P<0.01）；免疫熒光及組化可見SV40-PED細胞上分別有補體C3c、C4d和C5b-9的沉積；但NPSCs僅有C3c和C4d沉積，而未見C5b-9沉積；Western blot證明，clusterin在NPSCs的表達略強于SV40-PED；RT-PCR證實，NPSCs表達的CD59顯著強于SV40-PED，而CD46在此兩種細胞的表達無明顯差異。
　　 結論：N