調(diào)節(jié)性B細胞在胃癌免疫調(diào)控中的作用及機制研究.pdf

1、目的：免疫調(diào)節(jié)在胃癌發(fā)生發(fā)展及轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用。近來，研究發(fā)現(xiàn)一群具有調(diào)節(jié)作用的B淋巴亞群——稱為調(diào)節(jié)性B淋巴細胞(regulatory B cells，Breg)。Breg在自身免疫性疾病中的研究已經(jīng)取得了初步研究結(jié)果，但是Breg在胃癌中的作用并不清楚。本研究以原發(fā)性胃癌(gastric cancer，GC)為研究對象，檢測調(diào)節(jié)性B淋巴細胞(Breg)在胃癌中的百分比變化，探討其在胃癌中的表面標(biāo)志特性，研究Breg細胞在胃癌中可能

2、的作用及相關(guān)機制，為調(diào)節(jié)性B淋巴細胞在胃癌及人類腫瘤甚至其在其他疾病中的研究提供研究基礎(chǔ)。
　　方法：(1)用流式細胞儀分析的方法測定40例健康對照組(Healthy control，HC)和107例原發(fā)性胃癌患者(gastric cancer，GC)外周血中CD19+B淋巴的百分比的狀況，研究胃癌患者外周血B淋巴百分比與其腫瘤TNM分期的關(guān)系。免疫組織化學(xué)染色的方法檢測不同TNM分期胃癌患者腫瘤組織局部CD19+B淋巴細胞的分布

3、情況。通過流式細胞術(shù)的方法檢測和分析胃癌患者正常組織、癌旁組織及腫瘤組織中CD19+B淋巴細胞(CD45+CD19+)在淋巴細胞中的百分比。(2) ELISA方法檢測胃癌患者血清中分泌的細胞因子IL-10的水平。流式細胞術(shù)分析胃癌患者外周血PBMC及癌旁組織及腫瘤組織B淋巴細胞中CD19+ IL-10+B淋巴細胞的百分比。(3)采用多色流式細胞術(shù)檢測表面標(biāo)志CD5、CD1d、CD24、CD38、IgM、CD25、CD10、CD21、CD

4、20各指標(biāo)在IL-10+B淋巴細胞和IL-10-B淋巴細胞表面平均熒光強度(MFI)表達的不同，確定Breg細胞合適的表面標(biāo)志為CD19+ CD24hiCD38hi。(4)流式細胞術(shù)分析胃癌患者外周血PBMC及腫瘤組織淋巴細胞中CD19+CD24hi CD38hi在CD19+B淋巴細胞的百分比變化，分析Breg細胞百分比與腫瘤TNM分期的可能關(guān)系。(5)通過流式細胞術(shù)分析胃癌患者體內(nèi)中CD3+T淋巴細胞、CD3+ CD4+ Th淋巴細胞

5、、CD3+ CD8+ Tc淋巴細胞、CD3-CD19+B淋巴細胞、CD3-(CD16+56)+NK淋巴細胞、CD3+(CD16+56)+ NKT淋巴細胞的百分比，詳細分析胃癌患者中各功能細胞亞群如CD4+ IFN-γ+ Th1細胞、CD4+ IL-4+ Th2細胞和CD4+ FoxP3+ Treg細胞的百分比變化。(6)進一步分析胃癌患者中CD19+CD24hi CD38hi Breg細胞與各細胞亞群的相關(guān)關(guān)系。(7)采用流式細胞分選技

6、術(shù)、CFSE染色、細胞共培養(yǎng)、流式細胞檢測等方法研究CD19+ CD24hi CD38hi Breg細胞對CD3+T淋巴細胞、CD3+ CD4+ Th淋巴細胞、CD3+ CD8+ Tc淋巴細胞亞群增殖的影響，檢測Breg細胞對Th淋巴細胞、Tc淋巴細胞分泌細胞因子的影響，檢測Breg細胞對Treg細胞轉(zhuǎn)化生成的影響。(8)通過功能抗體中和阻斷實驗評估IL-10及TGF-β在Treg細胞轉(zhuǎn)化過程中是否起到作用。研究中統(tǒng)計分析采用Graph

7、Pad Prism5.0軟件分析。
　　結(jié)果：(1)40例健康對照和107例胃癌患者外周血標(biāo)本中B淋巴細胞的百分比無明顯差異（14.03％±4.39％ vs15.06％±7.47％，P＞0.05）。(2)胃癌患者不同TNM分期（Ⅰ期18例、Ⅱ期40例、Ⅲ期46例和Ⅳ期3例），分析其外周血中B淋巴細胞百分比與TNM分期的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)不同TNM分期其外周血中B淋巴細胞百分比不同，Ⅰ期＞Ⅱ期＞Ⅲ期，但Ⅳ期例外:TNMⅢ期胃癌患者外周血CD

8、19+B淋巴細胞的百分比顯著低于TNMⅠ期患者(P＜0.001)，而且低于TNMⅡ期患者(P＜0.05)，而TNMⅣ患者外周血B淋巴細胞百分比增高，高于TNMⅢ期患者，兩組間差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。(3)流式細胞術(shù)及免疫組織化學(xué)染色都檢測到大量B淋巴細胞在腫瘤組織局部的聚集。(4)ELISA檢測發(fā)現(xiàn)胃癌患者外周血中細胞因子IL-10明顯高于健康對照組(P＜0.001)。流式細胞術(shù)的檢測發(fā)現(xiàn)胃癌患者外周血中CD19+ IL-1

9、0+B細胞百分比顯著高于健康對照組(P＜0.001)。采用流式細胞術(shù)的檢測方法，檢測胃癌患者外周血PBMC及癌旁組織、腫瘤組織B淋巴細胞中CD19+IL-10+B淋巴細胞的百分比，發(fā)現(xiàn)胃癌患者腫瘤組織中CD19+ IL-10+B細胞百分比高于癌旁組織(P＜0.05)，顯著高于外周血PBMC(P＜0.01)。(5)多色流式細胞術(shù)分析IL-10+B淋巴細胞表面的特征發(fā)現(xiàn)，IL-10+B淋巴細胞上CD5、CD38、CD24和CD25的熒光強度

10、明顯高于IL-10-B淋巴細胞(P＜0.001)，IL-10+B淋巴細胞上CD1d、IgM和CD10的熒光強度高于IL-10-B淋巴細胞(P＜0.01)，IL-10+B淋巴細胞上CD21的熒光強度高于IL-10-B淋巴細胞(P＜0.05)，而CD20的表達在IL-10+B淋巴細胞和IL-10-B淋巴細胞兩群細胞之間無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05）。分析發(fā)現(xiàn)CD19+ CD24hi CD38hi B細胞分泌大量IL-10，以此表面標(biāo)記作為胃癌

11、中Breg細胞的表面特征，用于后續(xù)的功能研究。(6)統(tǒng)計分析發(fā)現(xiàn)，胃癌患者組外周血中CD19+ CD24hi CD38hi Breg細胞百分比顯著高于健康對照組(P＜0.001)，將胃癌早期（即TNMⅠ期和TNMⅡ期）與胃癌晚期（即TNMⅢ期和TNMⅣ期）比較分析，統(tǒng)計分析發(fā)現(xiàn)CD19+ CD24hi CD38hi Breg細胞百分比隨著TNM分期的增加而有增高的趨勢，但兩組間并無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05）。(7)流式細胞術(shù)分析胃癌患者

12、中各功能細胞亞群如CD4+ IFN-γ+ Th1細胞、CD4+ IL-4+ Th2細胞和CD4+ FoxP3+ Treg細胞的表達，發(fā)現(xiàn)胃癌患者外周血CD4+ IFN-γ+ Th1細胞的百分比明顯低于健康對照組(P＜0.01)，Th2細胞的百分比在健康對照組和胃癌患者組之間無統(tǒng)計學(xué)差異，發(fā)現(xiàn)胃癌患者外周血中Treg細胞的百分比明顯高于健康對照組(P＜0.01)。(8)進一步分析胃癌患者中CD19+ CD24hi CD38hi Breg細

13、胞與各細胞亞群的相關(guān)關(guān)系。統(tǒng)計分析發(fā)現(xiàn)，Breg細胞與CD3+T淋巴細胞(R=0.3917，P＜0.05）、CD3+ CD8+ Tc淋巴細胞(R=0.5100，P＜0.01)具有直線相關(guān)性，而且Breg細胞與CD4+ FoxP3+ Treg細胞具有較好的直線相關(guān)性(R=0.4252，P＜0.01)。(9)研究CD19+ CD24hi CD38hiBreg細胞功能發(fā)現(xiàn)，Breg細胞對CD3+T細胞、Th細胞、Tc細胞增殖無明顯影響(P＞0

14、.05)，但對CD4+ Th細胞分泌細胞因子IFN-γ和TNF-a均具有明顯抑制作用(P＜0.01)。(10)進一步研究發(fā)現(xiàn)CD19+ CD24hi CD38hi Breg細胞可以誘導(dǎo)CD4+ CD25-效應(yīng)性T細胞表達FoxP3水平顯著增高（P＜0.01）。而且研究發(fā)現(xiàn)，胃癌患者體內(nèi)的CD19+ CD24hiCD38hi Breg細胞可以誘導(dǎo)CD4+ CD25-效應(yīng)性T細胞表達FoxP3水平高于健康對照組(P＜0.05)。不僅Real

15、-Time PCR在mRNA水平上證實，流式細胞術(shù)也檢測到CD19+ CD24hi CD38hi Breg細胞除了可以分泌大量IL-10以外，也可以分泌大量TGF-β。通過中和實驗證實，在CD19+ CD24hi CD38hi Breg細胞誘導(dǎo)CD4+CD25-效應(yīng)性T細胞表達FoxP3的過程中，此功能的發(fā)揮不是依賴IL-10，而是依賴TGF-β。
　　結(jié)論：胃癌外周血中CD19+ CD24hi CD38hi Breg細胞百分比的

16、增高，而且隨著TNM分期增加存在著增高的趨勢，提示Breg細胞可能與腫瘤的發(fā)展相關(guān)。CD19+CD24hi CD38hi Breg可以抑制Th細胞因子的分泌，而且同時以TGF-3依賴的途徑誘導(dǎo)Treg細胞的增多，Breg細胞可能打破了機體的抗腫瘤免疫，參與了胃癌的免疫逃逸，參與了胃癌的發(fā)生發(fā)展和轉(zhuǎn)移?？紤]到Breg細胞在腫瘤中可能發(fā)揮的抑制腫瘤的效應(yīng)，特異性去除減少或降低胃癌患者體內(nèi)的Breg細胞的水平，或許可以提高機體的抗腫瘤免疫應(yīng)答