光皮樺天然群體遺傳多樣性研究.pdf

1、運用表型標(biāo)記和RAPD標(biāo)記對福建境內(nèi)9個光皮樺(Betula luminifera H.Winkl.)天然群體共135個個體樣本進行遺傳多樣性和遺傳結(jié)構(gòu)分析，初步揭示了研究群體的遺傳多樣性現(xiàn)狀及其分布格局，同時對兩種標(biāo)記方法進行了比較分析，旨在為光皮樺種質(zhì)資源的保護、遺傳改良以及永續(xù)利用提供依據(jù)。本研究的主要內(nèi)容和結(jié)果如下： 1.對9個光皮樺天然群體135個單株的7個葉片性狀、3個果序性狀及5個種子Jl生狀等15項形態(tài)指標(biāo)進行

2、表型多樣性分析，探討群體間和群體內(nèi)的表型變異程度與規(guī)律。結(jié)果表明，光皮樺種內(nèi)表型性狀在群體間和群體內(nèi)存在豐富的遺傳變異：光皮樺葉、果序和種子3類表型性狀的變異系數(shù)分別為0.1779、0.1056和0.1930，其中果序性狀穩(wěn)定性高于葉性狀和種子性狀；群體間平均表型分化系數(shù)(Vst)為0.3503，群體間的變異(35.03％)小于群體內(nèi)的變異(64.97％)：群體內(nèi)表型變異系數(shù)由大到小的排序為：wp(o.1288)>YA(0.1264)>

3、LC(0.1153)>YX(0.1126)>sw(0.1078)>WY(0.0966)>MX(0.0953)>SX(0.0755)>SL(0.0509)。光皮樺表型性狀間及其與地理氣候因子相關(guān)分析表明，光皮樺表型性狀間存在顯著或極顯著相關(guān)關(guān)系，種內(nèi)群體的葉、果序、種子性狀變異也存在較明顯的地理變異趨勢。聚類分析將9個光皮樺天然群體劃分為3類：SX、MX、LC、YA和WP五個群體聚為一類，SW、WY和YX三個群體聚為一類，SL群體獨立為一

4、類。 2.通過比較實驗，建立了光皮樺基因組DNA的簡便提取方法和葉片保存方法；通過參數(shù)優(yōu)化，篩選出一套適合于光皮樺RAPD反應(yīng)的擴增程序和擴增體系。 (1)為從富含次生代謝物的光皮樺嫩葉中獲得高質(zhì)量的DNA，實驗設(shè)計了5種先提核再提DNA的CTAB法Ⅰ、CTAB法Ⅱ、CTAB法Ⅲ、CTAB法Ⅳ和改良的SDS法，應(yīng)用于光皮樺基因組DNA的提取，并采用瓊脂糖凝膠電泳、A<,260/A280>比值測定、限制性內(nèi)切酶消化和PCR

5、擴增等對所提取的DNA進行比較分析。結(jié)果表明：用改良的CTAB法Ⅰ提取的DNA完全可滿足RAPD分析的要求。 (2)以光皮樺新鮮嫩葉為對照，比較了-20℃冷藏、硅膠干燥、改進的飽和NaCI-CTAB溶液保存和核分離緩沖液固定4種鮮葉保存方法對光皮樺基因組DNA提取效果的影響，并以提取的核酸得率、純度、片段分布情況、是否含有PCR反應(yīng)抑制劑等指標(biāo)來評價其保存效果。結(jié)果表明：-20℃冷藏的樣品未能提到DNA；鮮葉、改進的飽和NaC

6、l-CTAB溶液保存和核分離緩沖液保存的葉片均能提到純度較好的DNA，大小在48kb左右，得率約為400 μgg<'-1>鮮葉，并獲得條帶清晰、多態(tài)性好的PCR擴增圖譜;用硅膠干燥保存的葉片也能提到DNA，但得率低(51.2 μg.g<'-1>鮮葉)，且未獲得條帶完整、清晰的PCR擴增圖譜。 (3)為確保RAPD反應(yīng)結(jié)果的重復(fù)性和真實性，對RAPD反應(yīng)的變性時間、退火溫度和退火時間進行篩選，優(yōu)選的程序為：95℃預(yù)變性300s；

7、94℃變性30s，40℃退火90s，72℃延伸120s，循環(huán)41次；最后在72℃延伸300s。同時，采用單因素設(shè)計和均勻設(shè)計對光皮樺的RAPD反應(yīng)體系進行優(yōu)化，并對兩種設(shè)計方案優(yōu)化出的最佳反應(yīng)體系的可靠性和穩(wěn)定性進行了比較分析。結(jié)果表明：兩種設(shè)計均可用于光皮樺RAPD體系的優(yōu)化，但單因素設(shè)計受多因素間交互作用的影響使RAPD反應(yīng)體系達不到最優(yōu)；而均勻設(shè)計能避免盲目性，可快速得到條帶清晰、穩(wěn)定性好的擴增帶譜。通過兩次均勻設(shè)計優(yōu)化，得出適合

8、光皮樺RAPD反應(yīng)的擴增體系為：dNTP0.2 mmol·L<'-1>，引物0.4μmol·L<'-1>，模板30 ng·20μL<'-1>，MgCl<,2> 2.5 mmol·L<'-1>，Taq DNA聚合酶1 U·20μL<'-1>。 3．利用RAPD標(biāo)記對9個光皮樺天然群體共135個個體的遺傳多樣性和群體遺傳結(jié)構(gòu)進行分析，結(jié)果表明：21個隨機寡核苷酸引物共檢測到225個位點，其中多態(tài)位點203個，占90.22％：物種水

9、平的Shannon多樣性指數(shù)I=0.4908，Nei’s基因多樣度h=0.3323 綜合評價9個群體，YA群體的DNA水平遺傳多樣性最高，其次是WP、SX、LC、WY、MX、SW、YX，而SL群體DNA水平的遺傳多樣性最低。分子方差分析(AMOVA)結(jié)果表明，光皮樺群體的遺傳變異主要存在于群體內(nèi)(占71.31％)，群體間的變異組分只占28.69％，這與利用Shannon多樣性指數(shù)估算的分化(Hsp-Hpop)IHsp=O.3250和Ne

10、i’s遺傳分化系數(shù)Gst=O.2809的結(jié)果相一致。UPGMA聚類分析將9個群體分為3個不同類群：YA、MX、WP、LC、YX群體為一類，SX、SW、WY群體為一類，SL群體單獨為一類。 4．從實驗樣本、遺傳多樣性參數(shù)、遺傳多樣性的梯度變異、遺傳多樣性分布和遺傳多樣性評價的應(yīng)用等方面進行光皮樺天然群體表型標(biāo)記和RAPD標(biāo)記的比較分析。結(jié)果表明：RAPD標(biāo)記揭示的種內(nèi)遺傳多樣性水平比表型標(biāo)記高，群體分化以表型的分化水平(Vst=