AGEs促進ROS的產生激活P38MAPK-JNK信號通路誘導大鼠內皮祖細胞凋亡的實驗研究.pdf

1、目的:內皮祖細胞(Endothelial Progenitor Cells，EPCs)由來源于機體骨髓、外周血等部位的單個核細胞分化而來，可分裂增殖成為成熟的血管內皮細胞，因此能夠促進血管的新生并具有強大的損傷血管修復功能。目前，糖尿病血管病變已成為影響人類健康的一個重要威脅，而對糖尿病所致的血管病變發(fā)病機理的大量研究表明，該過程中EPCs的凋亡起著明顯的作用。細胞凋亡是細胞由自體基因調控的，自主的、程序性的死亡過程，當各種原因導致EP

2、Cs內鈣、磷水平急劇升高，則可導致細胞凋亡并形成凋亡小體。晚期糖基化終末產物(Advanced Glycation End products，AGEs)是指機體內的脂質、蛋白質以及核酸等游離基于無酶作用條件下，自發(fā)的與各種還原單糖反應所生成的穩(wěn)定、不可逆轉的共價結合物，是高糖環(huán)境下誘導細胞凋亡的主要物質，正常的生理狀態(tài)下AGEs幾乎不表達，而在糖尿病患者中AGEs的表達明顯增加，從而導致了一系列的病理過程。而這一過程中細胞體內眾多的生物

3、傳導信號通路均參與其中，尤其是絲裂原活化蛋白激酶(Mitogen-activated Protein Kinases) MAPKs即為其中最重要的一組信號通路，有研究報道稱抑制氧化應激反應(Oxidative Stress)同時亦可抑制AGEs誘導的EPCs凋亡。因此本實驗主要通過觀察體外AGEs是否通過氧化應激激活MAPK信號通路從而誘導大鼠骨髓源性EPCs凋亡及其具體的機制。
　　方法:采用脫臼SD大鼠頸椎的方法處死SD大鼠，

4、后于75％酒精中浸泡消毒20分鐘。消毒后將SD大鼠置于紫外線照射后的超凈工作臺中，使用解剖器械分離大鼠脛骨及股骨，完成分離后，采用含有1％肝素的無菌PBS液沖洗股、脛骨骨髓腔直至骨髓腔變成無色透明為止，將沖洗液收集，高速離心機離心后小心收集離心管底部細胞，采用Ficoll密度梯度離心法培養(yǎng)和分離大鼠骨髓源性單核細胞，成功分離出單核細胞后，采用清潔巴氏管吸取細胞懸液后均勻滴于6孔板之中，初次換液為3天，后換液時間為每隔3-4天，使用倒置顯

5、微鏡定期觀察細胞形態(tài)變化，并使用激光共聚焦顯微鏡鑒定經DiI-acLDL和FITC-UEA-1雙熒光染色的EPCs。采用流式細胞儀檢測經不同濃度的AGEs(50ug/l、100ug/l、200ug/l)以及200ug/l濃度AGEs干預處理不同時間(6h、12h、24h、48h)后EPCs的凋亡率，后采用Western Blot檢測不同濃度及不同時間對EPCs中凋亡蛋白Bax及凋亡抑制蛋白Bcl-2的表達以及JNK和P38MAPK信號通

6、路磷酸化產物的活化情況;使用分子探針(DCFH-DA)檢測200ug/l濃度AGEs干預處理不同時間(3h、6h、12h、24h)后EPCs中活性氧簇(Reactive OxygenSpecies)ROS的表達量;NAC(抗氧化劑)預處理EPCs1h后使用200ug/lAGEs干預24h后檢測ROS表達的含量以及Bax蛋白相對表達量;為進一步證明P38MAPK和JNK在EPCs凋亡具體機制中的作用，分別使用經典的JNK抑制劑SP6001

7、25(20um)和P38MAPK的抑制劑SB203580(20um)干預EPCs1h后，采用Western Blot檢測促凋亡蛋白Bax、凋亡抑制蛋白Bcl-2和JNK、P38MAPK磷酸化產物的活化情況。
　　結果:將骨髓中的單個核細胞成功分離后，采用EGM-2完全培養(yǎng)基于專用細胞孵箱中培養(yǎng)3天后觀察，見70％以上的EPCs貼壁，并呈圓形，少有呈橢圓形、梭形或紡錘形，孵箱繼續(xù)培養(yǎng)至第7天后，鏡下可見EPCs生長迅速，此時觀察已可

8、見細胞初步呈集落樣生長，以上細胞再次培養(yǎng)至14天后，再次鏡下觀察可發(fā)現細胞出現典型“鋪路石”樣、漩渦樣生長。后為明確所培養(yǎng)細胞為EPCs，取出孵育7天后的EPCs進行鑒定，采用DIL-acLDL與FITC-UEA-1“雙吞”實驗，使用共聚焦顯微鏡觀察、鑒定細胞，經DIL-acLDL染色后EPCs表現為紅色熒光，而EPCs結合了FITC-UEA-1后則表現為黃色熒光，紅黃熒光雙染色細胞被證明為EPCs。所有細胞經干預之前均采用不含血清的基

9、礎培養(yǎng)基“饑餓”處理24h。后分別予以不同濃度梯度(0ug/ml、50ug/ml、100ug/ml、200ug/ml)AGEs-BSA干預、刺激EPCs24h后，凋亡細胞比率隨著AGEs濃度的增加而進行性升高，凋亡率分別為5.94％、9.83％、24.81％，以及200ug/ml濃度AGEs-BSA分別經不同時間點刺激(6h、12h、24h、48h)細胞凋亡呈時間依耐性增加，但24h時為頂峰，凋亡率分別為15.83％、22.75％、27

10、.86％、23.24％，促凋亡蛋白Bax相對表達量同樣也呈時間、濃度依耐性增加(24h時達到頂峰)，而凋亡抑制蛋白Bcl-2相對表達量則呈時間、濃度依耐性降低。同時Western blot檢測P-P38MAPK、P-JNK、T-P38MAPK、T-JNK蛋白含量的表達，隨著AGEs-BSA濃度(0ug/ml、50ug/ml、100ug/ml、200ug/ml)的升高P-P38MAPK、P-JNK的相對表達量呈濃度相關性增加（分別為P-P

11、38MAPK,0.28±0.01、0.33±0.01、0.41±0.02, vs Medium組，P＜0.01, n=3; P-JNK1.08±0.02、1.36±0.01、1.75±0.01, vs Medium組，P＜0.01，n=3)。而隨著時間的變化P-P38MAPK在24h內呈時間相關性增加，24h時相對表達量達到頂峰后逐漸下降，P-JNK相對表達量在12h內呈時間相關性增加，12h時達到頂峰后逐漸下降，無論是時間還是濃度的變

12、化，T-JNK和T-P38MAPK的表達量均沒有發(fā)生任何變化。經過DCFH-DA檢測200ug/l濃度AGEs干預處理不同時間(3h、6h、12h、24h)后EPCs中ROS的表達量，可見隨著時間的增加EPCs內ROS含量的生成亦呈上升趨勢（DCFH-DA熒光的相對表達量分別為114.41％、119.49％、131.36％、128.32％vsMedium組，P＜0.01，n=3），于12h時達到頂峰，后逐漸下降。而在加入抗氧化劑NAC過

13、后，ROS的產生、Bax凋亡促進蛋白含量的表達均明顯下降DCFH-DA相對熒光值明顯減少為98.21％vs133.51％(p＜0.01，n=3)，而WesterBlot檢測Bax蛋白含量的表達明顯降低(0.86±0.01vs0.24±0.01，P＜0.01，n=3)，同僅采用200ug/mlAGEs-BSA干預的對照組比較，具有顯著的統(tǒng)計學意義(P＜0.01)。在加入JNK抑制劑(SP600125，20um)后，同濃度為200ug/ml

14、AGEs刺激組相比Bax、P-JNK表達明顯減少（分別為0.95±0.01vs0.40±0.01, P＜0.01, n=3;1.05±0.01vs0.25±0.01,P＜0.01，n=3)，而Bcl-2的表達明顯增加(0.19±0.01vs0.59±0.01，P＜0.01，n=3)。在加入p38MAPK的抑制劑SB203580(20uM)預處理后，同濃度為200ug/ml的AGEs-BSA刺激組相比Bax、P-p38MAPK表達明顯減少