DATS通過誘導HL-60細胞產(chǎn)生ROS激活JNK的分子機制.pdf

1、目的:探討DATS誘導HL-60細胞JNK活化的分子機制及活性氧在這一過程中的作用。
　　方法:用濃度為50、100、150μM的DATS處理HL-60細胞0、0.5、1、3、6、12h,流式細胞術檢測細胞內(nèi)的ROS水平。用抗氧化劑N-乙酰半胱氨酸(N-acetyl-L-cysteine,NAC)預孵育HL-60細胞30min后,再用150μM DATS處理HL-60細胞0、0.5、1、3、6、12h,流式細胞術檢測細胞內(nèi)的ROS

2、水平;蛋白印跡法檢測JNK、c-Jun、GST-π和JIP的表達及JNK、c-Jun和MLK3的磷酸化水平;免疫共沉淀和蛋白印跡技術分析GST-π與JNK、JIP與JNK的結合情況;用MLK特異性阻滯劑CEP-1347或JNK特異性阻滯劑SP600125預處理后,觀察150μM DATS處理細胞3h后,HL-60細胞JNK、c-Jun磷酸化的變化。
　　結果:不同濃度DATS處理HL-60細胞不同時間后,細胞流式檢測顯示ROS的產(chǎn)

3、生與DATS處理呈時間劑量依賴關系,在0.5-3h隨著DATS處理時間和濃度的升高而升高,ROS的熒光強度在3h、150μM時達到最高峰,值為89.7±3.67,其后維持在一個較高水平。
　　DATS處理HL-60細胞在12h內(nèi),幾乎不影響JNK蛋白的表達,c-Jun蛋白表達在前3h內(nèi)有所增高,隨后趨于穩(wěn)定;JNK的磷酸化水平在 DATS處理3h內(nèi)顯著增高,3h達到最高峰,隨后稍有下降;c-Jun、MLK3的磷酸化水平隨著時間的延

4、長而增加,NAC能不同程度的抑制DATS誘導的c-Jun的表達及JNK、c-Jun的磷酸化;CEP-1347預處理細胞能降低DATS誘導的JNK的磷酸化水平,SP600125預處理細胞能顯著降低DATS誘導的c-Jun的磷酸化水平。
　　DATS處理細胞6h內(nèi),幾乎不影響GST-π的表達,12h時,DATS能抑制GST-π的表達;DATS處理幾乎不影響JIP的表達;DATS處理HL-60細胞0-3h,DATS能誘導GST-π與JN

5、K復合物的解離,3h時GST-π與JNK基本處于解離狀態(tài),3h后GST-π重新與JNK結合,NAC能顯著抑制DATS誘導的GST-π與JNK復合物的解離;DATS處理HL-60細胞0-3h,DATS能誘導JIP與JNK復合物的形成,3小時以后JIP與JNK復合物逐漸解離。NAC對JIP與JNK復合物的形成無明顯影響。
　　結論:
　　1.DATS能誘導HL-60細胞產(chǎn)生ROS及MLK3、JNK和c-Jun的磷酸化;