中慢生華癸根瘤菌群體感應(yīng)系統(tǒng)自體誘導(dǎo)物合成相關(guān)基因的篩選、鑒定及對(duì)共生結(jié)瘤的影響.pdf

1、根瘤菌可以在豆科植物根部形成根瘤從而固定空氣中的N2，這其中包括了一系列不同的信號(hào)傳導(dǎo)過程。在許多根瘤菌中發(fā)現(xiàn)LuxR-LuxI類群體感應(yīng)是其中重要的信號(hào)傳遞系統(tǒng)之一，它能調(diào)控根瘤菌許多生理功能例如結(jié)瘤效率，共生體的形成，胞外多糖的產(chǎn)生和固氮效率等。 利用本實(shí)驗(yàn)室所構(gòu)建的高效檢測(cè)菌JZA1在中慢生華癸根瘤菌Mesorhizobium huakuii As9中檢測(cè)到自體誘導(dǎo)物分子的存在，定量的β-半乳糖苷酶活性檢測(cè)與定性的反向薄層

2、層析檢測(cè)表明該菌株可以產(chǎn)生較高活性的自體誘導(dǎo)物分子。 為了研究該群體感應(yīng)系統(tǒng)，本實(shí)驗(yàn)通過構(gòu)建轉(zhuǎn)座子文庫的方法，成功地篩選到了兩株不產(chǎn)生自體誘導(dǎo)物的突變株YQ1和YQ2。兩突變株自體誘導(dǎo)物活性與野生型相比都明顯降低。為了確定突變株中轉(zhuǎn)座子的插入位點(diǎn)，運(yùn)用了任意PCR(arbitrary PCR)的方法得到了轉(zhuǎn)座子兩端的基因序列。結(jié)果顯示：突變株YQ1中轉(zhuǎn)座子插入一個(gè)639bp的ORF內(nèi)部，經(jīng)BlastX分析，它所編碼的212個(gè)氨基

3、酸與Mesorhizobium loti MAFF303099中AHL合成酶mrl5638同源性高達(dá)99％，將其命名為mrhI；突變株YQ2中轉(zhuǎn)座子插入一個(gè)732bp的ORF之上，經(jīng)BlastX分析，它與Mesorhizobium loti MAFF303099中調(diào)節(jié)蛋白mrl5637同源性高達(dá)97％。 為了研究Mesorhizobium huakuii As9中AHL合成酶基因mrhI的表達(dá)情況，PCR擴(kuò)增mrhI基因的中間片

4、斷并克隆至pVIK112中，與野生型菌株的mrhI區(qū)域進(jìn)行同源交換后獲得了mrhI-lacZ融合表達(dá)菌株YQ3。在菌株YQ3的培養(yǎng)液中加入不同濃度菌株YQO的培養(yǎng)物上清液，待菌體生長(zhǎng)到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，對(duì)菌體直接進(jìn)行β-半乳糖苷酶活性檢測(cè)，結(jié)果顯示，隨著外源上清液濃度增加，lacZ的活性也隨著增高，群體感應(yīng)調(diào)節(jié)蛋白基因mrhI呈自體誘導(dǎo)的方式，只有在具有高活性AHLs的野生型菌株上清液存在時(shí)mrhI才能夠被誘導(dǎo)表達(dá)，而mrhI突變株的上清液并

5、不能誘導(dǎo)mrhI的表達(dá).這說明mrhI的表達(dá)是受其自身合成的信號(hào)因子AHLs分子的調(diào)控。 結(jié)瘤試驗(yàn)顯示：接種根瘤菌16天后，接種野生型和接種突變株的植株根部均能觀察到結(jié)瘤現(xiàn)象，但與野生型菌株相比，接種突變菌株的紫云英植株所結(jié)瘤的數(shù)目比野生型少。這說明突變菌株對(duì)其寄主植物紫云英的結(jié)瘤能力有一定的影響，在Mesorhizobium huakuii As9與宿主植物的共生過程中，群體感應(yīng)發(fā)揮著一定的調(diào)節(jié)作用，但確切的作用機(jī)制目前尚不清