苜蓿中華根瘤菌刀豆氨酸外運(yùn)系統(tǒng)SsiR-SsiAB調(diào)控機(jī)制的研究及其對共生結(jié)瘤的影響.pdf

1、苜蓿中華根瘤菌可以與牧草植物苜蓿和草木樨共生結(jié)瘤。本文選擇本實(shí)驗(yàn)室分離的苜蓿中華根瘤菌Sinorhizobium medicae1128為研究對象，用質(zhì)粒pJZ260上的mariner轉(zhuǎn)座子隨機(jī)插入苜蓿中華根瘤菌以建立突變文庫，用無啟動子的卡那霉素抗性基因（KmR）為報(bào)告基因，以其宿主植物紫花苜蓿種子浸提物為誘導(dǎo)物，從中篩選到能夠誘導(dǎo)其卡那霉素抗性基因表達(dá)的4株突變株（命名為smA，SmB，smC和smD.），經(jīng)過ArbitrayPCR

2、擴(kuò)增、DNA測序以及BLAST分析后確定轉(zhuǎn)座子插入的基因與LysE家族外運(yùn)蛋白、組氨酸氨解酶、咪唑酮丙酸酶、NADH：黃素氧化酶基因同源。
　　 同時通過轉(zhuǎn)錄融合報(bào)告基因lacZ的方法證實(shí)ssiA以及其下游基因ssiB都能被種子浸提物及刀豆氨酸誘導(dǎo)，但誘導(dǎo)能力不同，ssiA-lacZ比ssiB-lacZ的誘導(dǎo)能力強(qiáng)。通過不同的氨基酸誘導(dǎo)asiA-lacZ和ssiB-lacZ發(fā)現(xiàn)，ssiA-1acZ和ssiB-lacZ都能被刀豆氨

3、酸誘導(dǎo)，而其他的常見堿性氨基酸不能誘導(dǎo)其表達(dá)，通過比對發(fā)現(xiàn)，ssiA基因與中慢生型天山根瘤菌的刀豆氨酸外運(yùn)基因msiA具有75％的同源性，可能為刀豆氨酸外運(yùn)有關(guān)的基因，而ssiB卻與之沒有同源性。而后通過基因敲除和互補(bǔ)表達(dá)asiA上游ssiR的方法證明，和LysR類轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)蛋白同源的SsiR蛋白可能是asiA和ssiB基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)蛋白，此蛋白也與中慢生型天山根瘤菌的msiA的調(diào)節(jié)蛋白MsiR有75％的同源性。
　　 在體外無酵

4、母粉含量的情況下，刀豆氨酸對ssiA和ssiB單獨(dú)缺失和同時缺失的突變株的毒性要比野生型高，同時發(fā)現(xiàn)ssiA缺失突變株比ssiB缺失突變株對刀豆氨酸更敏感，ssiAB對不同的濃度的刀豆氨酸敏感程度也不同，這說明雖然可能ssiA和ssiB表達(dá)的蛋白可能都為刀豆氨酸外運(yùn)蛋白，但外運(yùn)能力不同。
　　 根毛吸附實(shí)驗(yàn)和共生結(jié)瘤實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，ssiA，ssiB和同時缺失都能導(dǎo)致吸附能力的降低，這是由于突變株對苜蓿分泌的大量的刀豆氨酸敏感造成的。

5、隨后的共生結(jié)瘤實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)前期ssiA和ssiAB的突變株都能造成結(jié)瘤數(shù)的下降和結(jié)瘤率的下降，但45天后差異更小或沒有差異，很可能是隨著植株的生長，分泌的刀豆氨酸減少造成的。
　　 根據(jù)上述試驗(yàn)數(shù)據(jù)提出苜蓿根瘤菌Sinorhizobiun medicae1128的SsiR/SsiAB系統(tǒng)和其宿主苜蓿種子浸提物中刀豆氨酸的互作模型：在苜蓿生長初期，種子和植株分泌大量的殺菌物質(zhì)刀豆氨酸刀豆氨酸可能殺死植株周圍潛在的有害細(xì)菌，而對苜蓿生長