華癸根瘤菌7653R中RND型外排泵家族基因的共生功能研究.pdf

1、雖然細(xì)菌外排泵的研究歷史較長(zhǎng)，其涉及的藥物運(yùn)輸功能研究主要集中在病原菌中，根瘤菌中外排泵的研究較少，外排泵系統(tǒng)相關(guān)基因在根瘤菌共生固氮中的功能表型和作用機(jī)制也值得深入研究。本文研究了華癸中慢生根瘤菌7653R中RND家族基因的功能。獲得了如下實(shí)驗(yàn)結(jié)果:
　　一方面，基于前期工作中的根瘤菌7653R轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，分析發(fā)現(xiàn)MCHK_0866、MCHK_0867兩個(gè)基因在共生條件下明顯上調(diào)表達(dá)，這兩個(gè)基因表達(dá)產(chǎn)物組成一個(gè)RND型外排泵。對(duì)

2、外排泵編碼基因及候選調(diào)控基因在基因組上的組織結(jié)構(gòu)進(jìn)行了分析。采用測(cè)定OD600觀察菌株生長(zhǎng)曲線的變化。通過(guò)測(cè)定最低抑菌濃度檢測(cè)菌株的藥物敏感性，RT-PCR檢測(cè)目的基因經(jīng)特定物質(zhì)處理后表達(dá)量的變化。通過(guò)細(xì)菌單雜交系統(tǒng)初步檢測(cè)外排泵的轉(zhuǎn)錄調(diào)控。結(jié)果顯示，MCHK_0866和MCHK_0867所編碼蛋白共同組成一個(gè)RND家族射流泵。缺失該外排泵后，細(xì)菌生長(zhǎng)曲線在穩(wěn)定期OD600數(shù)值降低，對(duì)萘啶酸、四環(huán)素和SDS的敏感性發(fā)生變化，萘啶酸處理細(xì)

3、菌后兩個(gè)基因的表達(dá)量增加。下游屬于TetR轉(zhuǎn)錄因子家族的基因MCHK_0869表達(dá)產(chǎn)物作用于MCHK_0867的啟動(dòng)子區(qū)域。該外排泵與萘啶酸的運(yùn)輸有關(guān)，缺失后自生生長(zhǎng)受到影響，表達(dá)受到下游轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控。MCHK_0867插入失活后對(duì)結(jié)瘤能力和固氮酶活影響較大，與雙突變菌株共生表型相似。
　　另一方面，本文選取另外3個(gè)在共生根瘤中表達(dá)水平無(wú)顯著變化的RND家族基因，分別構(gòu)建了其基因插入失活突變株。對(duì)突變菌株進(jìn)行了共生表型實(shí)驗(yàn)。結(jié)果