中慢生天山根瘤菌胞外多糖在共生過程中的功能研究.pdf

1、根瘤菌與宿主植物的共生結瘤過程，需要各種多糖類物質的參與。根瘤菌能產生胞外多糖(EPS)、莢膜多糖(KPS)、脂多糖(LPS)和環(huán)狀葡聚糖四種多糖類物質。根瘤菌體表的胞外多糖不僅具有富集環(huán)境中營養(yǎng)元素的功能，還對于無定型根瘤的共生固氮過程具有重要作用，它可以作為根瘤菌與宿主植物相互作用時的信號分子，在協(xié)助根瘤菌吸附宿主根毛，改變宿主根毛細胞骨架結構、促進侵入線形成、決定宿主專一性、保護自身抵御宿主防御系統(tǒng)反應等共生過程中具有更為復雜的作

2、用。因此，深入研究根瘤菌胞外多糖的合成、調控及其在共生過程中的作用有助于了解根瘤菌和宿主相互作用時的信號交流機制。根瘤菌胞外多糖的合成及分泌運輸過程需要很多的基因參與，對于根瘤菌胞外多糖合成的調節(jié)也是一個十分復雜的過程，不僅受氮、磷含量等多種環(huán)境因素影響，也受自身多種調節(jié)基因的調節(jié)。在中華苜蓿根瘤菌(S.meliloti)中，exo基因參與了胞外多糖的合成過程；exoQ、exoT和exoP參與了胞外多糖的多聚化過程；exsA參與了胞外多

3、糖分泌運輸過程；ExoS-ChvI群體感應系統(tǒng)參與調控中華苜蓿根瘤菌Ⅱ型胞外多糖的合成過程。中慢生天山根瘤菌分離自我國新疆干旱地區(qū)，可以與其宿主植物烏拉爾甘草共生結瘤。中慢生天山根瘤菌的群體感應系統(tǒng)對于共生結瘤過程具有重要作用，而其胞外多糖在共生過程中的作用還未曾深入研究。
　　 本研究以中慢生天山根瘤菌為材料，采用轉座子隨機插入突變的方法，篩選得到7株胞外多糖缺失突變株，在基本培養(yǎng)基上不能產生胞外多糖，與野生型菌落表形有明顯差

4、異。通過Arbitrary PCR的方法得到轉座子兩端的基因序列，確定突變株中的轉座子分別插入了與豌豆根瘤菌pssPONT、exo5基因有較高同源性的mtpABCD、mtpE上，并且克隆得到了完整的基因序列。經過實驗驗證mtpABCD、mtpE在基因組上是組成型表達。為了研究中慢生天山根瘤菌胞外多糖的調控機制，構建了mtpC-lacZ融合表達菌株WP1，該突變株沒有胞外多糖合成能力。用轉座子隨機插入突變的方法篩選胞外多糖基因mtpC的調

5、控基因，采用Arbitrary PCR的方法得到轉座子兩端的基因序列，并亞克隆得到了mtpSR雙組份調控系統(tǒng)的完整序列。mtpS編碼一個組氨酸激酶感應蛋白，mtpR編碼了一個調控蛋白。mtpSR與豌豆根瘤菌中的actSR、大豆根瘤菌中的regSR有較高的同源性，后兩者在共生固氮過程中有重要作用。為了進一步研究中慢生天山根瘤菌胞外多糖基因mtpC和雙組份調控系統(tǒng)mtpSR的調控機制，分別在野生型與mtpC-lacZ融合表達菌株WP1中構建

6、了mtpS、mtpR的缺失突變株。在野生型中分別缺失了mtpS和mtpR后，胞外多糖形成能力喪失；在mtpC-lacZ融合表達菌株WP1中缺失了mtpS和mtpR后，mtpC-laZ的β-半乳糖苷酶活性大大降低。這說明，mtpS和mtpR的缺失影響了mtpC的表達，mtpSR雙組分調控系統(tǒng)調控了胞外多糖相關基因mtpC的表達，mtpSR雙組分調控系統(tǒng)對于中慢生天山根瘤菌胞外多糖的形成非常重要。而mtpS和mtpR的缺失對mtpE的表達沒

7、有影響，mtpE可能受其他調控系統(tǒng)的調控。為了研究中慢生天山根瘤菌胞外多糖在共生過程中的作用，我們進行了根毛吸附、生物膜形成、共生結瘤實驗。與野生型相比，mtpC、mtpS、mtpR和mtpE的缺失突變株不僅不能形成胞外多糖，也不能形成生物膜，其根毛吸附能力與共生結瘤能力也完全喪失。這說明胞外多糖在中慢生天山根瘤菌的共生結瘤過程中起著十分重要的作用。由此，我們推測中慢生天山根瘤菌通過調節(jié)胞外多糖的形成來影響生物膜的形成，進而影響根毛吸附

8、、共生固氮等共生過程。中慢生型天山根瘤菌中存在一個與lysE/lysR調控系統(tǒng)相似的msiA/msiR系統(tǒng)，刀豆氨酸(CAN)作為特異性的信號分子可以與MsiR蛋白結合調控msiA，進而影響天山根瘤菌的共生過程。為研究MsiR蛋白關鍵氧基酸的功能，利用大腸桿菌XL1 Red菌株，構建得到msiR基因突變子文庫，以msiA-LacZ作為報告基因篩選得到10株MsiR蛋白不依賴于刀豆氨酸就能誘導msiA表達的突變株，與野生型相比，突變株中的