IFN-γ和TNF-α聯(lián)合作用誘導小鼠胰島細胞凋亡的機制研究.pdf

1、目的：研究IFN-γ和TNF-α對NOD/Ltj小鼠胰島細胞及胰島瘤細胞株MIN6凋亡的影響。
　　方法：
　　1.IFN-γ和TNF-α對NOD/Ltj小鼠胰島細胞活性的影響：分離NOD/Ltj小鼠胰島細胞，分別用IFN-γ單獨或與TNF-α聯(lián)合刺激細胞，MTT法分析細胞活力的變化。
　　2.IFN-γ和TNF-α對NOD/Ltj小鼠胰島瘤細胞系MIN6活性的影響：貼壁培養(yǎng)MIN6細胞，分別用IFN-γ、TNF-α和

2、 IFN-γ+TNF-α刺激細胞，MTT法分析MIN6細胞活力的變化；倒置顯微鏡下觀察分組刺激后MIN6細胞的形態(tài)學變化；Hoechst染細胞核后，激光共聚焦顯微鏡下觀察MIN6細胞核形態(tài)變化；提取MIN6細胞的DNA，瓊脂糖凝膠電泳，檢測DNA凋亡的片段大小情況；流式細胞術檢測細胞因子IFN-γ和TNF-α對MIN6細胞凋亡的影響。免疫印跡法檢測早期凋亡的MIN6細胞中caspase-3的表達情況。
　　結果：
　　1.M

3、TT法分析結果顯示，刺激48h后，IFN-γ對NOD/Ltj小鼠胰島細胞有毒性作用，并且IFN-γ與TNF-α聯(lián)合刺激對胰島活力有明顯的抑制作用。
　　2.MTT法分析顯示，單獨IFN-γ或TNF-α對MIN6細胞有一定的毒性作用，兩者聯(lián)合對MIN6細胞活力的抑制具有協(xié)同作用，并呈現(xiàn)明顯的時間依賴性（P＜0.05）。倒置顯微鏡下觀察到未處理組的細胞形態(tài)伸展良好，呈瓦片狀。IFN-γ和TNF-α聯(lián)合刺激12h，24h和48h后，細胞

4、形態(tài)從不規(guī)則的方形瓦片狀變化成圓球狀，最后部分細胞開始漂浮。激光共聚焦顯微鏡下觀察到IFN-γ或TNF-α單獨作用MIN6細胞，其細胞核形態(tài)與對照組相比差異性不明顯；但是二者同時作用時，MIN6細胞的細胞核表現(xiàn)出明顯的細胞核皺縮、染色質濃縮等細胞凋亡特征。瓊脂糖凝膠電泳結果發(fā)現(xiàn)IFN-γ和TNF-α單獨刺激MIN6細胞48h后，與對照組比較，DNA有明顯的凋亡片段；其聯(lián)合刺激時，凋亡片段更多。流式細胞儀檢測結果表明細胞因子IFN-γ和T

5、NF-α對MIN6細胞的毒性具有顯著的協(xié)同作用，并且IFN-γ和TNF-α對MIN6細胞的毒性主要是誘導MIN6細胞的早期凋亡而不是壞死或者晚期凋亡。免疫印跡實驗表明 IFN-γ和TNF-α降低了MIN6細胞中caspase-3的表達。
　　結論：
　　1.細胞因子IFN-γ對小鼠胰島細胞有毒性作用，IFN-γ與TNF-α聯(lián)合刺激時，作用更明顯。
　　2.細胞因子IFN-γ和TNF-α對MIN6細胞具有毒性作用，并呈現(xiàn)