自噬在IFN-γ調(diào)控FasL誘導(dǎo)血管平滑肌細(xì)胞凋亡中的作用機(jī)制.pdf

1、目的：探討自噬在IFN-γ促進(jìn)FasL誘導(dǎo)血管平滑肌細(xì)胞凋亡中的作用及其相關(guān)分子機(jī)制。
　　方法：獲取SD大鼠胸主動(dòng)脈，應(yīng)用貼壁法分離并培養(yǎng)原代血管平滑肌細(xì)胞，分別給予IFN-γ或/和FasL處理，采用細(xì)胞計(jì)數(shù)、FCM檢測(cè)以及蛋白印跡實(shí)驗(yàn)分析法等實(shí)驗(yàn)方法，檢測(cè)不同處理因素對(duì)血管平滑肌細(xì)胞凋亡的影響。采用免疫熒光和蛋白印跡等檢測(cè)方法，明確IFN-γ對(duì)血管平滑肌細(xì)胞自噬的誘導(dǎo)作用，并探討自噬與IFN-γ聯(lián)合FasL誘導(dǎo)血管平滑肌細(xì)胞凋

2、亡中的作用，采用FCM檢測(cè)血管平滑肌細(xì)胞表面Fas的蛋白水平，并用自噬抑制劑預(yù)處理細(xì)胞，探討明確自噬與血管平滑肌細(xì)胞膜表面 Fas表達(dá)的中的作用。用慢病毒介導(dǎo)轉(zhuǎn)染FAP-1shRNA以敲低FAP-1表達(dá)，用蛋白印跡實(shí)驗(yàn)分析檢測(cè)載體用于細(xì)胞感染，獲得FAP-1低表達(dá)血管平滑肌細(xì)胞并用于實(shí)驗(yàn)。以蛋白印跡實(shí)驗(yàn)分析和FCM檢測(cè)血管平滑肌細(xì)胞內(nèi)和膜表面Fas表達(dá)的水平，以明確FAP-1對(duì)細(xì)胞膜表面Fas表達(dá)以及IFN-γ聯(lián)合 FasL誘導(dǎo)調(diào)控細(xì)胞

3、凋亡的影響。采用蛋白印跡實(shí)驗(yàn)分析Jak2/STAT1信號(hào)通路介導(dǎo)IFN-γ對(duì)細(xì)胞自噬調(diào)節(jié)作用。最后，再以不同抑制劑預(yù)處理平滑肌細(xì)胞，檢測(cè)在抑制劑存在的情況下，采用FCM分析IFN-γ對(duì)細(xì)胞膜表面Fas表達(dá)的影響，探討IFN-γ誘導(dǎo)血管平滑肌細(xì)胞自噬及Fas膜轉(zhuǎn)運(yùn)的的分子機(jī)制。
　　結(jié)果：IFN-γ或FasL的單獨(dú)處理血管平滑肌細(xì)胞并不能誘導(dǎo)明顯細(xì)胞凋亡，然而，兩者聯(lián)合作用可明顯引起平滑肌細(xì)胞凋亡。IFN-γ處理后可以觀察到血管平滑

4、肌細(xì)胞內(nèi)FAP-1的水平降低以及和細(xì)胞膜表面的Fas的表達(dá)增加，而自噬抑制劑預(yù)處理細(xì)胞能有效阻斷IFN-γ對(duì)FAP-1表達(dá)及細(xì)胞膜表面Fas蛋白水平的調(diào)節(jié)作用。同樣，敲低FAP-1基因表達(dá)也能使血管平滑肌細(xì)胞膜表面Fas的表達(dá)水平顯著增加。此外，血管平滑肌細(xì)胞經(jīng)IFN-γ處理，可導(dǎo)致Jak2及STAT1的磷酸化水平增加，但是使用 Jak和 STAT1的抑制劑后，分別預(yù)處理細(xì)胞，能有效抑制IFN-γ誘導(dǎo)細(xì)胞自噬和Fas膜表面轉(zhuǎn)運(yùn)。