IFN-α與IFN-γ聯合誘導表達的MAX蛋白抑制乙型肝炎病毒復制機制的初步研究.pdf

1、乙型肝炎病毒(HepatitisBvirus，HBV)感染引起的肝炎、肝硬化、甚至肝癌嚴重危害人類健康，但迄今無有效的治療方法。α伐干擾素(Ⅰ型干擾素)在臨床用于治療乙型肝炎已有20多年的應用歷史，但是有效率只有30-40﹪。γ干擾素(Ⅱ型干擾素)則是一類主要在免疫細胞中合成、可通過免疫調節(jié)而發(fā)揮抗病毒效應的細胞因子。已有研究發(fā)現聯合應用Ⅰ型和Ⅱ型干擾素可以上調ISGF3復合物的活性；也有研究報道聯合用藥可以增強對單純皰疹病毒、丙型肝炎

2、病毒、鼠肝炎病毒和SARS病毒復制的抑制作用。本課題組用I型和II型干擾素聯合處理肝源性細胞(Huh7)也發(fā)現能夠增強抑制乙型肝炎病毒復制。 為了探索聯合應用干擾素增加抗病毒作用的機制，將人肝源性細胞(Huh7)分別用α和Y干擾素聯合及單獨處理6h后抽提細胞RNA，用基因芯片(HGU—133A，Affymetrix公司)進行實驗，將雜交信號掃描后處理分析。根據已知的干擾素信號通路以及抗病毒蛋白，本實驗將Log2C—MAX(Log

3、2A,B)≥03c：聯合應用IFN-a和IFN-7處理組與對照組的基因變化譜；A，B：單獨應用IFN-a或IFN-y處理組與對照組的基因變化譜)的基因進行歸類和分析。結果發(fā)現，與單獨使用干擾素相比，聯合處理組共有137個基因在早期得到了增強，其中20個基因與抗病毒／免疫相關，26個基因與信號通路相關，23個基因與RNA相關，15個與蛋白折疊和降解相關，24個與細胞凋亡黏附等相關。有意義的是，除了許多己知的干擾素信號通路基因(JAK2、S

4、TATl和STAT2等)和抗病毒基因(ISGl5、OASL和ISG20等)得到增強外，還發(fā)現許多未報道可被干擾素誘導基因(MAX、Bcl-G等)的表達也得到了增強。挑選了部分基因進行定量PCR驗證，結果與芯片一致，證實基因表達譜結果的可靠性。 挑選部分聯合誘導表達基因克隆入真核表達載體得pcDNA-MAX和pcDNA-UBE2L6質粒，分別與HBV復制型質粒共轉染Huh-7細胞。結果發(fā)現MAX可抑制HBsAg和HBeAg的表達。

5、MAX屬于bHLHZ轉錄因子家族成員，可以形成同源二聚體或者異源二聚體，c-Myc必須通過E-box與MAX形成異源二聚體c-Myc-MAX從而激活細胞增殖和凋亡。其他的成員如Mad、Mxi—l和Mnt也可以與MAX形成異源二聚體對抗調節(jié)細胞周期。但是有關MAX蛋白在干擾素通路和抑制病毒復制方麗的研究尚未見報道。為了探討MAX在干擾素抑制HBV中的作用，進一步將MAX蛋白表達質粒與HBV復制型質粒瞬時共轉染肝細胞，檢測其對HBV基因復制

6、和表達的影響。結果顯示：與空載質粒的對照組相比，當MAX蛋白表達質粒分別以0.125、0.25、0.5μg與0.5μgHBV復制型質粒共轉染細胞時，細胞上清中HBsAg分別降低了19﹪、36﹪和61﹪，HBeAg分別降低了23﹪、37﹪和53﹪；抽提細胞內的HBVcoreparticleDNA，Real-timePCR檢測發(fā)現HBVDNA分別降低了28﹪、52﹪和80﹪。當MAX轉染劑量分別為1.25μg、2.5μg，HBV復制型質粒為

7、5μg時，Southernblot實驗結果顯示coreparticle中HBVDNA分別下降了60﹪和65﹪。當MAX轉染劑量分別為0．25μg、0.5μg、1μg，HBV復制型質粒為1μg時，HBVRNA在Northernblot實驗中分別下降了30﹪、70﹪和80﹪。上述結果提示MAX蛋白可以抑制HBV蛋白的合成、基因的轉錄和復制。此外，對ISRE的活性檢測提示發(fā)現MAX調節(jié)干擾素信號通路發(fā)揮抗病毒作用。 上述研究結果為進一