人胃賁門腺癌組織和正常胃黏膜組織蛋白質組雙向電泳圖譜的差異分析[001]

1、<p>　　人胃賁門腺癌組織和正常胃黏膜組織蛋白質組雙向電泳圖譜的差異分析</p><p>　　劉國紅，楊繼要，呼 琳，張欽憲★ （鄭州大學基礎醫(yī)學院組胚教研室，鄭州，450052） </p><p>　　關鍵詞 蛋白質組學;雙向電泳;賁門腺癌 </p><p>　　中圖分類號 R 735.2 文獻標識碼：A </p><p&

2、gt;　　賁門癌(Gastric cardia adenocarcinoma，GCA)是我國北方常見的惡性腫瘤之一,其最顯著的流行病學特征是與食管癌地域分布的一致性。在食管癌高發(fā)區(qū)河南省林州市及其相鄰地區(qū),賁門癌與食管癌發(fā)病率之比為1∶3.2,并且預后極差[1],目前仍然是該地區(qū)腫瘤相關主要死亡原因。目前GCA發(fā)病機制尚不明確，關于GCA的蛋白質組學研究少見報道。隨著雙向電泳技術和質譜分析等蛋白質組學相關技術的迅猛發(fā)展，從蛋白質組整體水

3、平研究腫瘤已成為可能。本研究采用雙向電泳技術分離賁門腺癌與正常胃黏膜組織總蛋白，獲得兩組的蛋白質表達譜，通過Imagemaster6.0軟件分析，尋找差異表達蛋白質，以期從蛋白質組整體水平研究賁門腺癌發(fā)生、演變過程中蛋白質表達變化，為闡明賁門腺癌發(fā)病分子機制、篩選早期診斷的特異性指標提供實驗依據(jù)。</p><p><b>　　1 材料與方法</b></p><p>&

4、lt;b>　　1.1 標本</b></p><p>　　8例賁門腺癌標本取自鄭州大學一附院手術患者，男性6例，女性2例。正常胃黏膜取自距賁門腺癌組織邊緣5cm以外部位，病理確認無增生和癌變。</p><p>　　1.2 主要試劑和儀器</p><p>　　pH 3～10、11cm線性IPG膠條、尿素、硫脲、CHAPS、DTT、碘乙酰銨、丙烯酰胺、甲

5、叉雙丙烯酰胺、硫代硫酸鈉、硝酸銀、EDTA、低熔點瓊脂糖；PROTEIN IEF CELL 等電聚焦儀、PROTEAN Iixi cell電泳儀、magicscan圖像獲取儀、Imagemaster6.0凝膠圖像分析軟件。 </p><p><b>　　1.4 方法</b></p><p>　　1.4.1 組織蛋白提取和定量</p><p>　

6、　取賁門腺癌或胃黏膜組織100mg剪碎，移入勻漿器，加入1ml組織裂解液于冰上勻漿，室溫靜置30min，轉入1.5mlEP管，冰上超聲破碎5 min。15000g離心30min,取上清再離心20min,取上清即為組織總蛋白，BrandFord法測蛋白濃度，分裝，-80℃保存。</p><p>　　1.4.2 雙向電泳（2-DE）</p><p>　　第1向等電聚焦電泳：參考PROTEIN

7、IEF CELL 等電聚焦儀操作指南進行。本實驗采用11cm線性PH3～10IPG膠條，蛋白上樣量100µg，水化上樣總體積200µl。第2向垂直電泳：膠條平衡后轉入12.5%SDS-PAGE分離膠，PROTEAN Iixi cell電泳儀上進行垂直電泳。</p><p>　　1.4.3凝膠銀染、圖像掃描和分析</p><p>　　凝膠銀染后magicscan掃描儀獲取

8、2-DE圖像，Imagemaster6.0軟件分析。蛋白質點變化（以vol%表示）[2]在賁門腺癌和胃黏膜間增多或減少2倍以上認定表達有差異。</p><p><b>　　2 結果</b></p><p>　　經(jīng)雙向電泳獲得了蛋白斑點清晰、重復性好的賁門腺癌和正常胃黏膜2-DE圖譜（圖1）。經(jīng)Imagemaster6.0軟件分析，蛋白主要分布在PI 4～7、相對分子質

9、量（20～90）×103范圍內，賁門腺癌組平均蛋白點數(shù)843±29個，平均匹配率76.9%。胃黏膜組平均蛋白點數(shù)827±36,平均匹配率80.3%。兩組間有47個差異表達蛋白，29個在癌組織高表達，18個低表達（圖2）。</p><p><b>　　A B</b></p><p>　　圖1 賁門腺癌組織(A)與胃黏膜組織（B）

10、2-DE圖譜</p><p>　　圖2 賁門腺癌(A)與胃黏膜組織(B)2-DE圖譜部分差異蛋白點放大圖</p><p><b>　　3 討論</b></p><p>　　賁門癌是指發(fā)生于食管賁門接合線以下2cm、鱗狀上皮和腺上皮交界區(qū)的胃賁門部的癌。近30年來,賁門癌的發(fā)生率呈穩(wěn)定上升趨勢,而胃遠端腫瘤卻明顯下降。賁門癌的發(fā)病機制尚不清楚,可

11、能與Barrett食管、賁門部腸化生、幽門螺桿菌、胃食管反流性疾病等因素相關[3]。因解剖位置的關系，賁門癌在發(fā)病情況、臨床癥狀、病理特征和治療方面都有其特殊性。此種特殊病種,診斷容易延誤,惡性程度高,以致療效欠佳,已引起臨床關注。</p><p>　　腫瘤蛋白質組學研究可以動態(tài)、整體、定量檢測腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中蛋白質種類、數(shù)量的改變[4]，從蛋白質組整體水平比較腫瘤組織/細胞與正常組織/細胞之間的蛋白質表達差異

12、，可從中發(fā)現(xiàn)腫瘤診斷、預后和治療的分子標志。蛋白質組學技術結合生物信息學對癌癥相關蛋白進行篩選和鑒定，為發(fā)現(xiàn)新的腫瘤標志物提供了新方法[5]。2-DE技術是目前蛋白質組學研究中分離蛋白質的主要技術[6]，相同條件下利用2-DE技術分離賁門腺癌和正常胃黏膜組織蛋白，獲得分辨率高、重復性好的2-DE圖譜，是篩選差異表達蛋白質的基礎。本研究以賁門腺癌組織為研究對象，對2-DE技術的程序及有關環(huán)節(jié)（如樣品處理、電泳參數(shù)和上樣量）進行反復改進和優(yōu)

13、化，初步建立了一套適合賁門腺癌蛋白質組研究的方法。</p><p>　　作者對8例賁門腺癌和胃黏膜組織總蛋白進行雙向電泳分離，獲得的2-DE圖譜分辨率高、蛋白點位置重復性好，組間具有很好的可比性。通過Imagemaster6.0軟件進行蛋白質斑點檢測和匹配分析，發(fā)現(xiàn)賁門腺癌和胃黏膜組織蛋白點多在PI 4～7，相對分子質量（20～90）×103范圍內，以蛋白質斑點變化2倍以上為標準，篩選出47個差異表達蛋

14、白點。由于本實驗是以賁門腺癌和配對胃黏膜為研究對象，因此篩選出的差異表達蛋白均可認為與賁門腺癌的發(fā)生相關，這為進一步篩選鑒定賁門腺癌相關蛋白、闡明賁門腺癌發(fā)生的分子機制提供了強有力的實驗依據(jù)。</p><p><b>　　參考文獻：</b></p><p>　　[1]Powell J,McConkey C C.Increasing incidence of adeno

15、carcinoma of the gastric cardia and adjacent sites[J].Br J Cancer,1990,62(3):440～443.</p><p>　　[2]黃文斌，張麗華.胃癌組織差異蛋白質表達譜的初步研究[J]. 醫(yī)學研究生學報，2007，20（9）：940～943．</p><p>　　[3]趙麗珍，鄭珂．賁門癌的發(fā)病機制研究現(xiàn)狀[J].國外醫(yī)

16、學．消化系疾病分冊，2003，4：231～233.</p><p>　　[4]Veenstra TD，Conrads TP，Hood BL，et al．Biomarker：mining the bioflid proteome．Mol Cell Proteomics，2005，4：409～418．</p><p>　　[5]黃文斌,周曉軍.蛋白質組學在消化系統(tǒng)腫瘤中的研究進展[J]．醫(yī)學研

17、究生學報，2004，17（5）：450～453．</p><p>　　[6]Simpson RJ，Dorow DS．Cancer proteomics：from signaling networks to tumor marker [J]．Trends Biotechnol，2001，19（suppl 10）：s40～s48． </p><p>　　作者簡介：劉國紅，女(河南?？h人)，碩士