甘蔗受黑穗病菌脅迫下microRNA差異表達及其靶基因功能分析.pdf

1、甘蔗（Saccharum spp.）是我國最重要的糖料作物和能源作物，蔗糖占我國食糖總產(chǎn)的92％。由黑粉菌（Sporisorium scitamineum，S.scitamineum）引起的甘蔗黑穗?。╯ugarcane smut），嚴重危害甘蔗生產(chǎn)，導致產(chǎn)量和蔗糖分降低，給我國甘蔗產(chǎn)業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟損失。培育抗黑穗病甘蔗品種是控制甘蔗黑穗病危害的最經(jīng)濟有效的手段。植物與病原互作的分子機制包括轉錄水平、轉錄后水平、翻譯水平、翻譯后水平

2、等多方面調(diào)控機制。隨著生物技術的發(fā)展，有關甘蔗與黑穗病菌互作分子機制的研究有了長足進步，但是尚未見利用高通量測序技術鑒定甘蔗受黑穗病菌脅迫后microRNA（miRNA）差異表達及其靶標基因預測和功能分析的報道。本研究首次利用高通量測序技術鑒定甘蔗受黑穗病菌脅迫下miRNA的差異表達，從甘蔗小RNA高通量測序與miRNA鑒定注釋、差異miRNA篩選和實時熒光定量PCR技術（qRT-PCR）表達驗證與表達模式分析、差異miRNA的功能分析

3、及其靶基因預測和靶基因表達分析等三個方面入手，系統(tǒng)比較了甘蔗與黑穗病菌互作系統(tǒng)的親和與不親和互作間在轉錄后水平上miRNA的調(diào)控機制，以期為甘蔗抗黑穗病分子機理的研究提供miRNA水平的佐證，豐富和深化甘蔗抗黑穗病的分子機理研究，進而為培育抗黑穗病甘蔗品種提供miRNA水平的理論依據(jù)。
　　miRNA具有重要的生物學功能，在植物受到生物和非生物脅迫的過程中發(fā)揮重要調(diào)控作用，其介導的轉錄后水平的基因調(diào)控是生物體內(nèi)一條重要的小RNA調(diào)

4、控路徑。本研究以甘蔗抗黑穗病無性系崖城05-179（YA05-179）和感黑穗病甘蔗品種新臺糖22（ROC22）為研究材料，以接種黑穗病菌蔗芽作為處理組（YAT、RT），接種清水作為對照組（YACK、RCK），應用高通量HiSeq測序技術鑒定甘蔗受黑穗病脅迫下48h的miRNA差異表達，對所獲得的小RNA序列注釋并篩選出差異表達的miRNA，利用生物信息學技術與數(shù)據(jù)庫結合對其靶向基因進行預測。實驗對篩選出的部分差異miRNA進行實時定量

5、驗證，并進一步分析了甘蔗與黑穗病菌互作0h、12h、48h和96h不同時間點miRNA與其部分靶基因的表達模式。研究旨在找到甘蔗在黑穗病菌脅迫下發(fā)揮關鍵調(diào)控作用的miRNA及其靶基因，為甘蔗抗黑穗病分子育種提供miRNA和基因資源。主要研究結果如下：
　　1.四個甘蔗樣品的送樣質量良好，分別測序得到符合要求的干凈序列為RCK36396588條、RT27812972條、YACK27464468條、YAT28290231條，且雜質序列

6、含量都少于1%，故高通量測序獲得的小RNA質量高。結合多個數(shù)據(jù)庫對測得的sRNAs進行篩選注釋，其中RCK測序獲得264個已知miRNA，RT有263個，YACK有260個，YAT有262個。此外，在RCK、RT、YACK和YAT中分別預測出137、140、111和119個新miRNA。有堿基分布統(tǒng)計分析結果顯示，四個小RNA文庫中在植物中含量較多的長度為21 nt和22 nt的新miRNA序列首位點堿基U所占比例較大；在序列堿基11位

7、點，四個樣品的新miRNA序列的堿基都偏向于A，符合miRNA序列特征，說明新miRNA序列的預測結果可行性高。
　　2.在ROC22中，篩選出231個已知miRNA，其中35個在黑穗病菌脅迫處理樣品和清水接種對照樣品間發(fā)生顯著差異表達（|log2-ratio|>1，P<0.05）；涉及10個上調(diào)表達和25個下調(diào)表達的miRNA；在對照組與處理組樣品中表達量差異倍數(shù)最高達4.6倍。在YA05-179中，兩個樣品中共有的已知miRN

8、A為208個，對照組與處理組中發(fā)生顯著差異表達miRNA有11個；涉及2個上調(diào)表達和9個下調(diào)表達的miRNA；對照組與處理組樣品中表達量差異倍數(shù)最高達2.1倍。在ROC22和YA05-179中，篩選出的差異表達的已知miRNA，下調(diào)表達的占多數(shù)，且大部分miRNA的種類和表達趨勢是相同的。在ROC22中，篩選出的顯著差異表達（|log2-ratio|>1，P<0.05）的新miRNA有16個，而YA05-179中有6個；其在單一品種特有

9、的比較多，且在兩個品種中沒有發(fā)現(xiàn)共同顯著差異表達的新miRNA。本研究針對篩選出的16個差異表達的已知miRNA和新miRNA，利用qRT-PCR對其在ROC22與YA05-179兩個品種中27個表達結果進行測序結果驗證，相符率達到了85.2%，可見本研究的測序結果可靠性較高。
　　3.甘蔗是個高度雜合的異源多倍非整倍體作物，其全基因組測序尚未完成，因此本研究注釋的miRNA未知序列占小RNA序列的絕大多數(shù)，隨后對所注釋的miRN

10、A在甘蔗受黑穗病菌脅迫時對應靶基因的預測及分析數(shù)據(jù)也不完整。差異表達的已知miRNA預測出的靶基因數(shù)，YA05-179少于ROC22，但差異表達的新miRNA對應的靶基因數(shù)目在YA05-179中明顯多于RO22。靶基因生物功能分析中，GO歸類為生物過程（biological process）、細胞組分和元件（cellular components）分子功能（molecular function）。兩個品種中，差異表達的已知miRNA靶基

11、因的分類情況與差異表達的新miRNA所匹配的靶基因序列統(tǒng)計情況相似，即在生物過程分類中靶基因主要分布在細胞過程與代謝過程，細胞組分和元件分類中靶基因主要分布在細胞、細胞組分和細胞器中，分子功能分類中靶基因主要分布在結合與催化活性。KEGG通路富集分析顯示，差異miRNA調(diào)控的靶基因參與了一系列miRNA調(diào)控靶基因生理生化途徑或抗病相關生理代謝和信號轉導途徑，表明甘蔗與黑穗病菌互作的分子機制是一個復雜網(wǎng)絡調(diào)控系統(tǒng)。研究發(fā)現(xiàn)，miR5077

12、、miR5671、miR5044、miR5261、miR5783、miR5221、miR6478和miR948的靶向基因在MAPK信號通路（MAPK signaling pathway）、植物激素信號轉導（Plant hormone signal transduction）和植物-病原菌互作（Plant-pathogen interaction）中發(fā)揮重要作用并構建了相關蛋白網(wǎng)絡調(diào)控圖。
　　4.從miRNA靶基因中篩選了在甘蔗E

13、ST文庫中有生物功能注釋的序列，并針對所篩選出的差異表達的已知miRNA和新miRNA所對應的部分靶基因進行了qRT-PCR表達分析。結果顯示，在已知miRNA與其靶基因的表達分析中，大部分miRNA與其靶基因呈負調(diào)控模式，即miRNA過表達時，靶基因的表達量呈下降趨勢；其中8個靶基因中有7個靶基因的表達在12h后基本相符，且在48h時匹配度最高。這也從另一方面說明甘蔗受黑穗病菌脅迫后miRNA對靶基因的調(diào)控作用在48h達到最高。研究還