NaCl脅迫下小黑楊差異表達基因及其功能分析.pdf

1、為研究小黑楊在不同鹽濃度和不同脅迫時間的生理響應(yīng),本實驗測定0、75、150、250 mM NaCl脅迫下,小黑楊第6小時和第1、2、4、6、8天的SOD活性、POD活性、MDA含量及葉綠素相對含量,結(jié)果表明:隨著脅迫時間的延長和鹽濃度的增加,小黑楊葉綠素相對含量逐漸降低,MDA含量升高。POD和SOD的活性則呈現(xiàn)逐漸增強后減弱的趨勢。通過對小黑楊葉部形態(tài)觀察發(fā)現(xiàn),250 mM NaCl脅迫第二天,葉片失水,葉柄變軟;隨著脅迫的持續(xù)進行

2、,葉片萎蔫變黃直至最后變成褐色,卷曲變脆。以上結(jié)果表明小黑楊并非強耐鹽植物,對低濃度鹽有一定耐受性,但高濃度鹽則會對其造成傷害。
　　 為進一步研究鹽脅迫下小黑楊基因應(yīng)答機理,以正常生長和鹽脅迫下的小黑楊葉片為試材,進行cDNA-AFLP分析。64對引物組合共獲得4407條轉(zhuǎn)錄基因片段,其中差異片段2027條(其中上調(diào)表達996條,下調(diào)表達1031條)?；厥?61條差異條帶,成功再擴增與克隆121條差異片段,測序得到107條原始

3、序列,經(jīng)聚類分析后得到86條唯一序列,Genbank登錄號為GW672587-GW672672,其功能涉及轉(zhuǎn)錄調(diào)控、應(yīng)激反應(yīng)、光合作用、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、代謝等10個功能類別。其中功能未知的基因占最高比例,約為18.6％;其次為參與代謝的基因,約占17.44％;參與轉(zhuǎn)錄調(diào)控的基因約為12.79％,信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的基因占11.63％;,與細胞合成相關(guān)的基因占10.47％,轉(zhuǎn)運占4.65％,細胞降解占4.65％,參與應(yīng)激反應(yīng)的基因占5.81％、發(fā)育相關(guān)基

4、因占6.98％、光合作用與氧化還原的基因均占6.98％。
　　 環(huán)鋅指蛋白基因是小黑楊鹽脅迫后誘導(dǎo)表達的基因,應(yīng)用RACE技術(shù)克隆出具有完整開放讀碼框的小黑楊環(huán)鋅指蛋白(PsnRZF)基因,該基因全長1061 bp,其中5’非翻譯區(qū)為184 bp,3’非翻譯區(qū)為82 bp,開放讀碼框為795 bp,編碼264個氨基酸,預(yù)測蛋白的分子量為30.25 kDa,理論等電點為8.04。實時定量PCR檢測的結(jié)果顯示;小黑楊PsnRZF基因

5、在不同器官中表達量存在差異,該基因在葉中的表達量最高,其次為莖,在根中的表達量最低。隨著脅迫時間的延長,PsnRZF基因在葉和莖中的表達量變化均呈現(xiàn)逐漸升高后降低的趨勢,在葉中該基因表達量峰值出現(xiàn)在脅迫后的第6天,在莖中該基因表達量峰值出現(xiàn)在脅迫后的第4天;而在根中,該基因表達量的變化不顯著。
　　 為驗證小黑楊環(huán)鋅指蛋白(PsnRZF)基因的功能,構(gòu)建植物表達載體,利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將小黑楊環(huán)鋅指蛋白基因?qū)霟煵葜小Ｍㄟ^對正常生