斯鈣素1在初生奶牛胃腸道的表達(dá)及其對(duì)氧化應(yīng)激和新型鈣離子通道的影響研究.pdf

1、斯鈣素1(Stanniocalcin1，STC-1)是一種最初在硬骨魚(yú)類發(fā)現(xiàn)的低鈣性激素，在魚(yú)類它是由緊鄰腎臟而且在整個(gè)腎臟中均有分布的特殊器官—斯坦尼氏小體所分泌，該激素主要通過(guò)調(diào)節(jié)腮、小腸和腎臟Ca2+和無(wú)機(jī)磷酸鹽(Inorganicphosphate，Pi)的轉(zhuǎn)運(yùn)來(lái)發(fā)揮其抗高鈣效應(yīng)。哺乳動(dòng)物體內(nèi)，STC-1在多種器官中均有表達(dá)，包括Ca2+吸收上皮如小腸、回腸、腎臟、胎盤以及其它血管化組織。哺乳動(dòng)物STC-1是一多功能效應(yīng)蛋白，如

2、它能調(diào)節(jié)腎臟和腸道Ca2+/Pi吸收，小鼠中其超表達(dá)可致高血Pi、侏儒癥、代謝率增加等效應(yīng)，近來(lái)發(fā)現(xiàn)它和癌癥也有一定的聯(lián)系。STC-1的表達(dá)受1，25(OH)2D3等理化因素調(diào)節(jié)。然而，STC-1在哺乳動(dòng)物中的多種生理作用還未完全清楚，還有待進(jìn)一步研究。
　　1.原核表達(dá)牛源STC-1重組蛋白
　　本試驗(yàn)以奶牛腎臟組織提取的總RNA合成cDNA，然后使用PCR技術(shù)擴(kuò)增出除信號(hào)肽序列外的奶牛STC-1全長(zhǎng)結(jié)構(gòu)基因。利用T-A克

3、隆原理將擴(kuò)增產(chǎn)物克隆到pMD-18T載體，轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)過(guò)夜培養(yǎng)后挑取單菌落進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，然后將菌液進(jìn)行測(cè)序。結(jié)果表明該擴(kuò)增產(chǎn)物和GenBank登錄號(hào)BC105435.1奶牛斯STC-1基因序列完全符合。然后將測(cè)序正確的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行雙酶切并亞克隆到pET-32a+表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化到感受態(tài)細(xì)胞Rosetta(DE3)中，經(jīng)0.6mMIPTG誘導(dǎo)3h后，成功表達(dá)出奶牛STC-1融合蛋白。
　　2.STC-1蛋白在奶牛胃腸道

4、差異性表達(dá)情況
　　本實(shí)驗(yàn)分別采用半定量實(shí)時(shí)熒光PCR和westernblotting技術(shù)來(lái)分析STC-1基因和蛋白相對(duì)表達(dá)量。STC-1基因表達(dá)情況以表達(dá)率形式予以展示:胃和腸道的相對(duì)表達(dá)值除以腎臟的相對(duì)表達(dá)值的百分?jǐn)?shù)。結(jié)果顯示，在胃中STC-1基因和蛋白表達(dá)量最高是在皺胃;而在腸道中十二指腸和結(jié)腸的基因表達(dá)量最高，蛋白表達(dá)量最高卻是在十二指腸和空腸。腎臟中STC-1基因和蛋白的表達(dá)量均高于胃腸道中的表達(dá)量。另外，本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)腸道

5、斯鈣素1在30bp處出現(xiàn)免疫條帶，說(shuō)明該STC-1可能分子量約為50kD(STC50)，而非更大分子量(bigSTC)。從結(jié)果可以看出STC-1表達(dá)最豐富的部位正好是胃腸道消化和吸收最活躍的部位，表明STC-1可能參與了奶牛消化與吸收過(guò)程。
　　3.新生牛小腸上皮細(xì)胞培養(yǎng)方法的建立
　　本實(shí)驗(yàn)建立了一種從新生犢牛小腸組織獲取小腸上皮細(xì)胞的方法。0.25％胰蛋白酶、0.1％膠原酶Ⅰ以及膠原酶Ⅺ/中性蛋白Ⅰ混合物等方法用于從小腸

6、組織分離小腸絨毛和隱窩。然后利用小腸上皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞的貼壁能力和對(duì)胰蛋白酶消化耐受性之間的差異來(lái)純化小腸上皮細(xì)胞。使用上皮細(xì)胞特異性角蛋白抗體進(jìn)行免疫細(xì)胞化學(xué)染色的方法來(lái)區(qū)別培養(yǎng)物中上皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞。光學(xué)和電子顯微鏡用于細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察。結(jié)果表明所有分離方法均能分離一定量隱窩和/或腸絨毛，但膠原酶Ⅰ分離效率更高、所得消化物結(jié)構(gòu)更完整，但需要消化很長(zhǎng)時(shí)間。原代培養(yǎng)物能在孵育3-7d內(nèi)貼壁，其間夾雜著一定量成纖維細(xì)胞和平滑肌樣細(xì)胞。經(jīng)

7、多種方法純化后，能得到較高純度的上皮樣細(xì)胞，該培養(yǎng)物能存活1.5月并傳代5-7次。從培養(yǎng)細(xì)胞中能克隆到蔗糖酶、鈣結(jié)合蛋白和上皮鈣離子通道，說(shuō)明該培養(yǎng)物保留了部分小腸上皮細(xì)胞生物活性。根據(jù)以上特點(diǎn)說(shuō)明該培養(yǎng)物能用于小腸上皮細(xì)胞功能的研究。
　　4.STC-1對(duì)過(guò)氧化氫誘導(dǎo)的奶牛腸道上皮細(xì)胞損傷的作用研究
　　該研究利用H2O2處理原代小腸上皮細(xì)胞以模擬慢性腸炎造成的細(xì)胞損傷。上皮細(xì)胞經(jīng)重組質(zhì)粒超表達(dá)STC-1后，再由200μM

8、H2O2處理不同時(shí)間，以研究STC-1對(duì)氧化損傷的作用。AO/EB雙染色和臺(tái)盼藍(lán)排除法用于鑒定細(xì)胞的損傷情況，STC-1和凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)情況由Real-timePCR和westernblotting方法檢測(cè)。結(jié)果表明STC-1基因和蛋白表達(dá)均隨H2O2誘導(dǎo)時(shí)間延長(zhǎng)而增加，H2O2誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷也具有時(shí)間依賴而加劇的趨勢(shì)，該趨勢(shì)能為STC-1過(guò)表達(dá)而逆轉(zhuǎn)。此外，細(xì)胞過(guò)表達(dá)STC-1也能上調(diào)凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2的表達(dá)，同時(shí)輕微下調(diào)cas

9、pase-3的表達(dá)。本實(shí)驗(yàn)表明STC-1保護(hù)細(xì)胞免受氧化損傷的可能機(jī)制之一是它具有抗氧化和抗凋亡作用，因此，STC-1是奶牛慢性腸炎的一個(gè)潛在診斷或治療指標(biāo)。
　　5.STC-1對(duì)Caco2細(xì)胞鈣離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白調(diào)節(jié)作用研究
　　本實(shí)驗(yàn)的目的是初步探索STC-1影響Ca2+吸收的可能分子機(jī)制，多種新型Ca2+通道和維生素D受體是本研究的對(duì)象。該實(shí)驗(yàn)采用外源導(dǎo)入真核表達(dá)載體的方式增強(qiáng)Caco2細(xì)胞STC-1的表達(dá)，導(dǎo)入特異性siR

10、NA的方式抑制該激素的表達(dá)，兩方面分別觀察TRPV5、TRPV6、PMCA1b、NCX1和VDR等鈣離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白表達(dá)水平。結(jié)果表明，增強(qiáng)STC-1表達(dá)后TRPV5、TRPV6和VDRmRNA和蛋白的表達(dá)水平均有所下調(diào)，而抑制了該激素的表達(dá)后TRPV5和TRPV6的表達(dá)有所上升，尤以TRPV6表達(dá)明顯，當(dāng)添加外源重組STC-1后，其表達(dá)又下調(diào)了。但增強(qiáng)和抑制該激素的表達(dá)都對(duì)PMCA1b和NCX1表達(dá)沒(méi)有顯著影響。因此，斯鈣素1影響上皮細(xì)胞