運動應激對大鼠心室肌細胞L型鈣離子通道的影響及機制.pdf

1、目的：應用膜片鉗技術(shù)，探索運動應激對大鼠心室肌細胞L型鈣離子通道的影響，并結(jié)合免疫組化的方法推測其可能存在的細胞內(nèi)機制。
　　方法：Wister大鼠20只，采自于河北醫(yī)科大學實驗動物中心，合格證號（1502056），體重200－250g，雌雄不限，隨機分為3個實驗組：對照組（不給于運動干預）、實驗組：運動應激組和運動應激＋藥物干預（每次運動前30min皮下注射salubrinal）。實驗組大鼠頭部負重（5％體重）運動9天。實驗前3

2、天，為動物適應性訓練期，運動應激組＋藥物干預組皮下注射用二甲基亞砜做溶劑的Salubrinal（1mg/kg），其余2組給予同等劑量的二甲基亞砜。隨后的9天實驗中，給予大鼠皮下注射Salubrinal（0.5mg/kg），運動后動物休息1天，繼而對大鼠進行急性心肌細胞分離、膜片鉗記錄L型鈣離子電流和免疫組化進行內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激標記物水平的分析。
　　大鼠心室肌細胞的分離：Wister大鼠，腹腔注射普通肝素5000U/Kg，20min后腹

3、腔注射1%戊巴比妥1ml/Kg；待麻醉完成后迅速開胸，取出心臟；置于4℃無鈣臺式液中沖洗后轉(zhuǎn)入4℃無鈣臺式液培養(yǎng)皿中，游離主動脈根部，插入主動脈套管，安置于Langendorff灌流裝置上；以無鈣臺式液8－10ml/min的灌流速度，灌流5－7min后，改用消化酶液灌流20min，灌流溫度37℃，流速8－10ml/min。將心臟從Langendorff裝置上取下，置于37℃KB液中溫育5－10min；剪去心房和右心室，留取左心室游離壁，

4、將左心室組織剪成2mm×2mm×2mm的碎塊，用粗開口巴氏吸管緩慢吹打5min。用200μm的微孔尼龍膜過濾。濾液于室溫下靜置30min，顯微鏡下觀察到上清液中多為死亡的心肌細胞或懸浮的細胞碎片時去除上清，加入KB液，重復3次，置于4℃保存?zhèn)溆谩?br>　　細胞存活率的測定：2ml巴氏吸管吸取1ml的細胞懸浮液，滴于載玻片上，滴入1滴0.2%的臺盼藍染色，死亡的心室肌細胞會被染成淡藍色。存活的細胞仍然會保持透亮，光滑的狀態(tài)。存活率（%）

5、=活細胞數(shù)/（活細胞數(shù)＋死亡的細胞數(shù)）×100%
　　免疫組化：Westernblot取分離好的心室肌細胞放入2.5ml離心管中，置于4℃離心機中12000轉(zhuǎn)/分離心15分鐘。充分棄上清液，加入裂解液50μl，4℃裂解30min后加入1:5上樣緩沖液，置于100℃的水浴鍋中煮沸10min。采用BCA法進行蛋白定量后，進行上樣開始SDS－PAGE凝膠電泳，完成電泳后將分離好的蛋白轉(zhuǎn)膜至PVDF膜。5%脫脂奶粉封閉1小時后，分別孵CH

6、OP、phospho－eIF2α和caspase－12一抗置于4℃，10小時后，PBS洗脫一抗，孵二抗（HRP－conjugatedantirabbitimmunoglobulinGantibod），1小時后開始ECL發(fā)光，并用G-BOX檢測結(jié)果。
　　應用全細胞膜片鉗技術(shù)，記錄急性分離的大鼠心室肌細胞L型鈣離子通道。用巴氏吸管吸取數(shù)滴心肌細胞的懸液置于倒置顯微鏡的灌流槽中，靜置5min待細胞貼壁后，利用記錄鈣離子的細胞外液（鈣外

7、液）灌流（2ml/min）沖掉死亡的心肌細胞，選取貼壁較好、紋理清晰、邊緣整齊、透亮、靜止不動且表面光滑的心肌細胞做全細胞膜片鉗記錄，電極為硬質(zhì)玻璃材質(zhì)（武漢微探極生產(chǎn)），經(jīng)過水平拉制儀（SutterP-97USA）四步拉制而成。然后用拋光儀（NarishigeScientificInstrumentLab.,Tokyo,Japan）對拉制好的微電極進行拋光處理。電極充灌鈣離子通道極內(nèi)液。安裝于膜片鉗的夾持器上針筒給予正壓，操縱三維操縱

8、器移動電極至電極貼于細胞表面，釋放正壓并適當給以負壓，使細胞與電極形成高阻封接（≥1GΩ）。調(diào)節(jié)快速補償，以抵消夾持器和電極管壁的快電容。繼續(xù)給予負壓吸破細胞膜，形成全細胞記錄，調(diào)節(jié)慢電容和串聯(lián)電阻以減少瞬時充放電時的電流鉗位誤差。脈沖信號由patchmaster軟件予以控制，通道信號由EPC-10（HEKA，Germany）膜片鉗放大器記錄并由patchmaster軟件對數(shù)據(jù)進行采集。實驗在20－25℃的室溫條件下進行，全細胞形成后穩(wěn)

9、定2min后進行數(shù)據(jù)的采集。
　　結(jié)果：1與對照組（n=4）相比運動應激組（n=4），內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激標記物phospho-eIF2α（1±0.50Vs2.31±0.87，P=0.04）、CCAT/enhancer-bindinghomologousprotein(CHOP)(1±0.30Vs3.13±1.20，P=0.034)和caspase-12表達均升高(1±0.44Vs2.6±0.84，P=0.014)并且存在統(tǒng)計學差異，推測運

10、動應激觸發(fā)了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激的機制。與對照組（n=12）相比運動應激組（n=9）的L型鈣離子通道電流密度峰值明顯減低（-3.80±1.26Vs-2.24±1.11，P=0.009）說明運動應激可以降低L型鈣離子通道電流。而這種降低可以被選擇性的eIF2α去磷酸化抑制劑salubrinal所阻斷，對照組（n=12）與運動應激＋salubrinal組（n=7）的L型鈣離子通道電流密度峰值變化沒有統(tǒng)計學差異（-3.80±1.26Vs-3.82±1.

11、49，P=0.979），運動應激組（n=9）與運動應激＋salubrinal組（n=7）相比L型鈣離子通道電流密度峰值明顯減低（-2.24±1.11Vs-3.82±1.49，P=0.03）。而salubrinal通常用于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激的抑制劑，這就提示內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激可能參與了對L型鈣離子通道電流的調(diào)節(jié)；2試驗中發(fā)現(xiàn)對照組（n=7，points=49），運動應激組（n=9，points=63）和運動應激＋salubrinal組（n=12，poin

12、ts=84），運動應激前后半數(shù)激活電壓（-21.06±1.07mVVs-19.39±1.64mVVs-17.69±1.26mV，P=0.96）的改變不存在統(tǒng)計學差異；對照組（n=7,points=42），運動應激組（n=8，points=48）和運動應激＋salubrinal組（n=12，points=72）運動應激前后半數(shù)失活電壓（-29.51±0.18mVVs-27.01±0.40mVVs-27.21±0.44mV，P=0.98）的