雞恒定鏈基因的克隆、表達及其抗體制備.pdf

1、該研究根據GenBank中登錄的雞Ii基因序列和載體pcDNA3的多克隆酶切位點設計一對引物,利用反轉錄-聚合酶鏈式反應(RT-PCR)技術從經過有絲分裂原刀豆蛋白A(ConA)刺激16h活化的雞脾淋巴細胞中擴增出大小約為672bp的基因;經單酶切鑒定,與已知的雞Ii基因含有相同的Pst Ⅰ酶切位點.將其克隆到載體pcDNA3中,并轉化宿主菌DH5 α,雙酶切方法鑒定重組質粒pcDNA3-Ii.進一步測定重組質粒pcDNA3-Ii中雞I

2、i基因的核苷酸序列,結果表明該基因完整開放閱讀框架(Open reading frame,ORF)由672個核苷酸組成,編碼223個氨基酸,與已知雞Ii基因序列相比有98％的同源性,證明該實驗成功的克隆到雞Ii基因.根據所克隆的雞Ii基因序列和原核表達載體PGEX-4T-1多克隆酶切位點設計另一對引物,應用PCR技術從重組質粒pcDNA3-Ii中擴增出含有完整ORF的雞Ii基因.再將擴增的雞Ii基因克隆到原核表達載體PGEX-4T-1中

3、,構建原核表達重組質粒PGEX-4T-l-Ii,并進行雙酶切鑒定.然后將該重組質粒轉化大腸桿菌BL21,經異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)于37℃誘導培養(yǎng)4h,表達出谷胱甘肽-S-轉移酶(GST)與Ii的融合蛋白GST-Ii.通過優(yōu)化原核表達條件,確定了原核表達的最佳誘導時間和誘導劑濃度.對表達蛋白的可溶性進行鑒定,結果表明表達產物GST-Ii融合蛋白以包涵體形式存在.我們用優(yōu)化的原核表達條件對含有PGEX-4T-1-Ii質粒的

4、BL21菌進行大量誘導表達,反復凍融和超聲方法裂解誘導菌,獲得濃度較高的GST-Ii包涵體蛋白,用十二烷基肌氨酸鈉加超聲波的方法使包涵體充分溶解,溶解的包涵體通過谷胱甘肽瓊脂糖親和層析獲得純化的GST-Ii融合蛋白.利用純化的GST-Ii融合蛋白作為抗原分別免疫家兔和小鼠制備兔抗雞Ii多克隆抗體和鼠抗雞Ii多克隆抗體.瓊脂擴散實驗表明制備的兩種多抗均具有良好的反應性,ELISA實驗表明兔多抗和鼠多抗的有效稀釋度分別可達1:25600和l