鵝催乳素受體基因克隆和多克隆抗體制備及組織表達分析.pdf

1、催乳素受體(Prolactin receptor，PRLR)是單次跨膜的受體蛋白，催乳素通過它在脊椎動物中起著廣泛的生理作用。為理解鵝PRLR的生理作用，我們應(yīng)用RACE(Rapidamplification of cDNA ends)技術(shù)克隆了全長為3，159bp的鵝催乳素受體基因(Prolactinreceptor gene，PRLR)cDNA并制備了PRLR兔抗鵝多克隆抗體，對洪澤湖鵝成體組織中mRNA及蛋白表達進行了分析。同時，

2、對洪澤湖鵝PRLR5’-UTR內(nèi)存在的一個SNP位點進行了驗證。
　　 1.鵝催乳素受體基因克隆及基因組織表達
　　 克隆的鵝PRLR cDNA全長3，159bp，含443bp5’-UTR、2，496bp編碼區(qū)和220bp3’-UTR，編碼14個或以上外顯子。預(yù)測鵝PRLR含831個氨基酸(Amino acid，aa)，與雞、鴿及火雞PRLR同源性分別為87.7，85.2和84.8％，N-末端含一個24aa信號肽，胞外域

3、含兩個配體結(jié)合區(qū)。每個配體結(jié)合區(qū)內(nèi)含二對半胱氨酸殘基和一個WSEWS五肽WS基序。進化分析表明，鵝PRLR在進化中高度保守。克隆的cDNA序列比對表明，成年公鵝睪丸至少同時表達五種PRLR轉(zhuǎn)錄本。其中一種轉(zhuǎn)錄本由另一種轉(zhuǎn)錄本缺失第1外顯子后95bp形成；第三種轉(zhuǎn)錄本由不同于以上二種轉(zhuǎn)錄本的另一啟動子選擇不同的轉(zhuǎn)錄起始點起動轉(zhuǎn)錄，產(chǎn)生一個新的第1外顯子，并直接剪接到第3外顯子而形成；第四種轉(zhuǎn)錄本缺失133bp的外顯子4a而不編碼或可能編碼

4、一種截短的PRLR蛋白異形體；第五種轉(zhuǎn)錄本是一種轉(zhuǎn)錄本異形體，編碼的蛋白異形體類似于非禽類其它脊椎動物PRLR，即胞外域只含有一個配體結(jié)合區(qū)。RT-PCR結(jié)果表明，鵝PRLR mRNA在成年鵝睪丸，輸精管、卵巢、輸卵管、腎、大腸、小腸、脾組織中均有表達，其中以腎、睪丸、大腸及小腸中表達最為豐富。
　　 2.鵝催乳素受體多克隆抗體制備及受體組織表達
　　 構(gòu)建的exPRLR-pET-28a(+)轉(zhuǎn)化宿主菌E.coli Ro

5、ster后，建立了可誘導(dǎo)的原核表達系統(tǒng)。在25℃培養(yǎng)、IPTG誘導(dǎo)條件下，表達催乳素受體胞外域重組蛋白exPRLR。超聲波裂解菌液上清及包涵體中的exPRLR使用Ni親和層吸柱純化，并用純化、復(fù)性的exPRLR免疫新西蘭白兔，制備兔抗鵝exPRLR抗血清，硫酸銨沉淀抗血清獲得多克隆抗體。然后多克隆抗體用原核表達的鵝PRLR胞外域重組蛋白及鵝組織表達的PRLR加以驗證。同時，組織表達分析表明，成年母鵝組織中至少存在三種PRIR蛋白，它們或

6、許是經(jīng)典的PRLR蛋白及PRLR的蛋白異形體。
　　 3.鵝催乳素受體基因單核酸多態(tài)性及微量動物細(xì)胞基因組DNA提取液
　　 克隆的cDNA序列比對發(fā)現(xiàn)2個錯配位點。位于編碼區(qū)內(nèi)的錯配位點推測可能是一種沉默SNP，不改變蛋白序列；位于5’-UTR的錯配位點在洪澤湖核心群內(nèi)被證明是一個SNP。同時，結(jié)合鵝微量羽髓細(xì)胞基因組DNA提取，我們研發(fā)了一種微量動物細(xì)胞基因組DNA提取液及相應(yīng)的提取方法。此方法實現(xiàn)了動物細(xì)胞基因組D