雞CD4基因片段的原核表達與單克隆抗體制備.pdf

1、CD4分子是T 淋巴細胞表面的Ⅰ型跨膜糖蛋白，也是T 淋巴細胞重要的表面標志。雞CD4基因定位于1 號染色體，基因全長11.5kb，共有10個外顯子。雞CD4基因編碼的成熟蛋白包含由四個類免疫球蛋白的胞外區(qū)（402個氨基酸），一個疏水跨膜區(qū)（24個氨基酸）和一個較長的胞漿區(qū)（33個氨基酸）組成。
　　 CD4分子主要存在于輔助性T細胞、調節(jié)性T細胞、單核細胞、巨噬細胞和樹突狀細胞表面。CD4分子作為輔助受體參與TCR 對MHCⅡ

2、類分子遞呈抗原的識別。
　　 CD4 還是一類信號傳遞受體，分子胞內部分通過酪氨酸激酶途徑參與經(jīng)TCR 介導的信號級聯(lián)反應，引發(fā)一系列的免疫應答。雞和哺乳動物的CD4分子在結構和功能上的保守性很高，這些保守性與雞的免疫系統(tǒng)緊密相關。為建立雞CD4分子的檢測方法，進一步研究其基因結構及其生物學作用，本研究進行了雞CD4分子基因片段的原核表達、單克隆抗體制備和單抗的免疫學活性鑒定。
　　 首先，參照GenBank中已經(jīng)登錄的

3、雞CD4 cDNA序列，以及pET-32a 載體多克隆位點序列設計了一對引物。利用PCR技術擴增了雞CD4分子中去除信號肽的N 端2個免疫球蛋白樣區(qū)基因片段。其大小為579bp，與GenBank中登錄的雞CD4(登錄號：Y12012)的序列進行比對，結果完全一致。將其插入表達載體pET-32a，獲得了重組表達載體pET-32a-CD4。將此重組表達載體轉化大腸桿菌BL21(DE3)，優(yōu)化表達條件后進行誘導以大量表達目的蛋白。裂解誘導培養(yǎng)

4、的菌體純化包涵體，包涵體再經(jīng)過體外溶解、復性后經(jīng)Ni-NTA 純化介質純化得到了His-CD4 融合蛋白，符合預測結果，大小約為42KD。表達產(chǎn)物經(jīng)His-NTA 樹脂親和層析柱分離純化，得到了純度較好的雞His-CD4 融合蛋白。
　　 其次，將純化后的His-CD4 融合蛋白免疫8周齡的Balb/c 小鼠。經(jīng)4 次免疫，血清抗體達到1：10000以上，取免疫小鼠的脾細胞與SP2/0細胞融合。經(jīng)多次亞克隆和細胞上清液中抗體檢測

5、，獲得一株陽性雜交瘤細胞株，命名為3E12。Western-blot實驗結果顯示，該細胞株上清液的抗體與目的蛋白發(fā)生特異性反應。將該細胞株注射Balb/c 小鼠腹腔，制備腹水，腹水抗體的間接ELISA 效價為1:105。用試劑盒鑒定的單抗的免疫球蛋白亞類為IgG2b。
　　 綜上所述，本研究在成功克隆雞CD4基因片段的基礎上，構建了表達重組載體pET-32a-CD4 質粒，并表達獲得了目的基因的融合蛋白。通過細胞融合制備了穩(wěn)定分