創(chuàng)傷弧菌溶細胞素膜成孔模序?qū)毎锬び绊懙难芯?pdf

1、目的:
　　1、研究創(chuàng)傷弧菌溶細胞素膜成孔模序(rMpf)的成孔毒性和生物活性。
　　2、研究rMpf對Hela細胞的生物膜功能和結(jié)構(gòu)的影響。
　　3、進一步完善創(chuàng)傷弧菌溶細胞素的結(jié)構(gòu)功能研究和對創(chuàng)傷弧菌致病機制的深入研究，為細菌膜成孔毒素對分子致病機理研究提供科學依據(jù)，也為進一步研發(fā)阻斷抗細菌成孔毒素毒力的藥物奠定基礎。
　　方法:
　　1、rMpf融合蛋白的表達、純化和復性
　　IPTG誘導含pE

2、T-28a(+)-mpf質(zhì)粒的E.coli BL21(DE3)工程菌，表達rMpf融合蛋白并用SDS-PAGE分析;三步洗滌法與Ni2+-NTA親和層析法聯(lián)合應用純化rMpf;利用稀釋復性與分步透析相結(jié)合的方案進行蛋白質(zhì)復性。膜聯(lián)蛋白-FITC/PI染色通過流式細胞儀檢測復性后rMpf活性。
　　2、rMpf融合蛋白對Hela細胞生物膜功能和結(jié)構(gòu)的影響
　　rMpf融合蛋白作用于Hela細胞，應用流式細胞術(shù)結(jié)合激光共聚焦顯微

3、鏡技術(shù)觀察DiI細胞膜熒光探針在rMpf作用后熒光分布的改變，MPTP檢測線粒體膜通道孔的形成與變化，JC-1檢測細胞線粒體膜電位變化，透射電鏡技術(shù)觀察細胞超微結(jié)構(gòu)的改變。
　　結(jié)果:
　　1、rMpf融合蛋白的表達、純化及復性
　　含pET-28a(+)-mpf重組質(zhì)粒的E.coli BL21(DE3)通過0.5 mmol/L IPTG誘導后，產(chǎn)生27kDa特異性表達條帶，經(jīng)三步洗滌與Ni2+-NTA柱純化后的純度約

4、為95.0％。復性后rMpf作用Hela細胞，顯示其具有較好的生物學活性和細胞毒性。
　　2、rMpf融合蛋白對Hela細胞生物膜的功能和結(jié)構(gòu)的改變
　　rMpf可使Hela細胞的細胞膜結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，rMpf還可使Hela細胞的線粒體膜通道孔活性發(fā)生改變，造成MPTP開放，線粒體膜電位下降。rMpf作用Hela細胞后其細胞膜和線粒體等一系列細胞器發(fā)生明顯的形態(tài)學改變，提示細胞可能已經(jīng)發(fā)生凋亡或壞死。
　　結(jié)論: