創(chuàng)傷弧菌溶細胞素融合蛋白誘導iNOS表達及初步機制研究.pdf

1、目的:
　　1、研究重組創(chuàng)傷弧菌溶細胞素融合蛋白(rVvhA)對小鼠巨噬細胞的體外毒性作用和吞噬功能的影響。
　　2、研究創(chuàng)傷弧菌溶細胞素融合蛋白(rVvhA)誘導小鼠巨噬細胞產(chǎn)生一氧化氮(NO)以及誘導型一氧化氮合酶(iNOS)表達的情況;觀察p38MAPK信號途徑對rVvhA和IFN-γ協(xié)同誘導J774A.1細胞NO合成的調(diào)節(jié)作用。
　　3、為探索創(chuàng)傷弧菌溶細胞素（vibro vulnificus cytolysi

2、n，VVC）的細胞毒性分子機制提供一些實驗依據(jù)。
　　方法:
　　1、誘導含pET-28a(+)vvhA重組質(zhì)粒的BL21大腸桿菌表達創(chuàng)傷弧菌溶細胞素融合蛋白，應(yīng)用Ni2+親和層析方法對rVvhA進行純化;利用分步稀釋加透析相結(jié)合的方法進行蛋白質(zhì)復性。
　　2、將復性純化蛋白作用于小鼠巨噬細胞（J774A.1、PMΦ），應(yīng)用MTT法、吞噬中性紅實驗、Griess法和熒光法分別檢測rVvhA對小鼠巨噬細胞的細胞毒性作用以

3、及刺激細胞一氧化氮合成、一氧化氮合酶活性的影響;應(yīng)用RT-PCR和免疫熒光法檢測rVvhA對小鼠J774A.1細胞iNOS mRNA和蛋白水平表達的影響。分析p38MAPK抑制劑對rVvhA誘導J774A.1細胞NO合成的調(diào)節(jié)，初步評價p38MAPK在rVvhA誘導巨噬細胞NO合成的信號通路中發(fā)揮的作用。
　　結(jié)果:
　　1、含pET-28a(+)vvhA重組質(zhì)粒的BL21大腸桿菌經(jīng)0.5mmol/L IPTG誘導后表達的融

4、合蛋白Mr約為54kDa,電泳結(jié)果與該融合蛋白的理論推算值基本相符。表達蛋白質(zhì)經(jīng)三步洗滌后，再經(jīng)Ni2+-NTA柱純化，其純度達88.0％左右。純化的rVvhA經(jīng)復性液復性后，具有溶血活性。
　　2、MTT和中性紅吞噬實驗結(jié)果顯示rVvhA具有降低小鼠巨噬細胞的存活率活性和吞噬功能，呈劑量依賴性;以脂多糖與IFN-γ協(xié)同作用作為陽性對照組，Griess法和熒光法實驗結(jié)果顯示在IFN-γ或rVvh單獨作用時，誘導巨噬細胞合成低量的N

5、O以及細胞內(nèi)NOS活性較低，但在IFN-γ存在時，濃度為1.6 HU/ml和1.2 HU/ml rVvhA分別誘導J774 A.1和PMΦ細胞24 h后，培養(yǎng)上清液NO濃度達峰值，且此濃度時增加細胞內(nèi)NOS活性;RT-PCR和免疫熒光法實驗結(jié)果顯示IFN-γ存在時，rVvhA增加 J774A.1細胞iNOS mRNA和蛋白水平表達。且p38MAPK抑制可一定程度降低J774A.1細胞培養(yǎng)上清液中NO的含量以及細胞內(nèi)NOS活性。
　

6、　結(jié)論:
　　本實驗證實，rVvhA具有通過干擾素-γ對信號依賴途徑誘導巨噬細胞NO合成的生物學活性。提示rVvhA誘導巨噬細胞NO合成增加，這一機制可能參與rVvhA的細胞毒性作用，NO可能作為一種生物信使分子和細胞毒效應(yīng)因子，形成瀑布效應(yīng)，加重病程進展。p38MAPK抑制劑可一定程度降低J774A.1細胞中NO合成和NOS活性，推測p38MAPK信號途徑可能參與rVvhA誘導巨噬細胞合成NO，但與rVvhA作用濃度和細胞類型有