抗創(chuàng)傷弧菌溶細胞素單克隆抗體的制備和鑒定.pdf

1、創(chuàng)傷弧菌(Vibrio vulnificus,Vv)是一種有莢膜的革蘭陰性嗜鹽弧菌,主要生長于海水中、魚類及貝母類等體內(nèi)<'[1]>.本菌感染主要引起原發(fā)性敗血癥<'[2]>和嚴重的創(chuàng)口感染.其中原發(fā)性敗血癥起病急驟,病程進展迅速,致死率高于50﹪,通常在發(fā)病后1-2周內(nèi)死亡<'[3]>.該病的確診需從病人的血液及創(chuàng)口分泌物中檢出創(chuàng)傷弧菌,給臨床快速診斷和治療帶來很大的困難. 關(guān)于創(chuàng)傷弧菌致病機制的研究發(fā)現(xiàn)創(chuàng)傷弧菌溶細胞素<'[

2、4]>(VVC)是創(chuàng)傷弧菌重要的致病因子.VVC是由創(chuàng)傷弧菌結(jié)構(gòu)基因vvhA編碼的一種相對分子質(zhì)量(Mr)為50 851Da的蛋白質(zhì),是創(chuàng)傷弧菌唯一釋放至胞外的細胞毒素,在創(chuàng)傷弧菌致病中起著重要作用. 本研究用利用雜交瘤技術(shù)建立能穩(wěn)定分泌抗創(chuàng)傷弧菌溶細胞素單克隆抗體的雜交瘤細胞株,對雜交瘤細胞及其單克隆抗體分析鑒定,為進一步研制創(chuàng)傷弧菌檢測試劑盒奠定基礎(chǔ). 實驗方法: 1.表達載體中目的基因的序列分析.

3、2.重組蛋白的表達及純化pET32a(+)-vvhA經(jīng)異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)誘導(dǎo),在大腸桿菌內(nèi)表達目的蛋白;超聲裂解細菌提取蛋白質(zhì),通過SDS-PAGE分析蛋白表達量;以HisTag單克隆抗體為一抗Western Blot分析重組蛋白的免疫反應(yīng)性;以Ni-NTA親和層析法收集表達的帶His.lag的目的蛋白. 3.單克隆抗體的制備將經(jīng)純化的目的蛋白免疫的BALB/c小鼠脾細胞與骨髓瘤SP2/0細胞進行融合,經(jīng)H

4、AT培養(yǎng)基選擇培養(yǎng),用間接ELISA法進行雜交瘤細胞篩選.抗體陽性細胞經(jīng)連續(xù)3次克隆后,建立穩(wěn)定分泌抗創(chuàng)傷弧菌溶細胞素單克隆抗體的雜交瘤細胞株. 4.雜交瘤細胞及單克隆抗體的鑒定用雙向瓊脂擴散法測定單克隆抗體的Ig類別和亞類.細胞連續(xù)傳代三個月及液氮凍存一個月后復(fù)蘇,不同時間取其培養(yǎng)液上清,用間接ELISA法檢測其抗體效價,測定抗體分泌的穩(wěn)定性. 采用ELISA法將金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、霍亂弧菌、產(chǎn)氣莢膜梭菌超聲破碎

5、抗原分別與所得單克隆抗體進行反應(yīng),對單克隆抗體的特異性進行測定,同時用雙向瓊脂擴散法予以驗證. 結(jié)果：1.表達載體中目的基因的序列分析表達載體中目的基因的測序結(jié)果與文獻報道的序列比較,所克隆的vvhA基因核苷酸和氨基酸序列同源性分別為96.09﹪和98.26﹪,同源性比較時不包括引物序列. 2.重組蛋白的表達及純化0.5mmol/1 IPTG在28℃3h以上能很好地誘導(dǎo)rVVC的表達,其表達量高達細菌總蛋白30﹪左右;'

6、Western BlotZ結(jié)果顯示與His.Tag單克隆抗體良好的免疫反應(yīng)性;經(jīng)超聲處理后Ni-NTA親和層析法純化,純度達90﹪以上. 3.單克隆抗體的制備對連續(xù)3次克隆的雜交瘤細胞用間接ELISA方法進行篩選,建立了2株(C2D6和E6F3)穩(wěn)定分泌抗創(chuàng)傷弧菌溶細胞素單克隆抗體的雜交瘤細胞株. 4.雜交瘤細胞及單克隆抗體的鑒定雜交瘤細胞連續(xù)傳代三個月,分泌抗體的能力穩(wěn)定;液氮凍存一個月后復(fù)蘇,對細胞上清進行檢測,抗體

7、仍為陽性.經(jīng)免疫雙擴散法測定,C2D6和E6F3株分泌的抗rVVC單克隆抗體類型均為IgGl型. 純化的C2D6和E6F3單克隆抗體與金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、霍亂弧菌、產(chǎn)氣莢膜梭菌超聲破碎抗原用ELISA法及免疫雙擴法檢測,結(jié)果均為陰性. 結(jié)論： 本實驗用Ni-NTA親和層析法純化所得蛋白作為抗原免疫BAI,B/c小鼠,利用雜交瘤技術(shù),共獲得了2株穩(wěn)定分泌特異性、高效價抗創(chuàng)傷弧菌溶細胞素單克隆抗體的雜交瘤細胞株