低頻超聲輻照聯(lián)合小劑量緩激肽增加血腫瘤屏障通透性機制的研究.pdf

1、腦膠質瘤是中樞神經系統(tǒng)常見的惡性腫瘤，其發(fā)病率約占顱內腫瘤的45％，傳統(tǒng)多采用手術治療。由于腦膠質瘤呈浸潤性生長，大多與正常腦細胞組織無明顯分界，一些部位深的腫瘤常侵犯腦重要功能區(qū)，手術難以切除根治，化療是其主要的治療方法之一。在腦膠質瘤中，即使腫瘤組織可以局部、不均一地破壞血腦屏障(BBB)，但是血腫瘤屏障(BTB)的存在仍然限制藥物進入腫瘤組織。常規(guī)化療的失敗不是因為藥物本身，而是沒有足夠的藥物進入腫瘤組織。尤其是近年來，隨著分子生

2、物學技術的發(fā)展，許多肽類，蛋白質，多核苷酸等物質作為潛在的抗腫瘤藥物的發(fā)現(xiàn)，由于其分子量大無法穿透BTB，限制了這些藥物的臨床應用。藥物通過BTB一般有兩種途徑：細胞旁途徑和跨細胞途徑。根據(jù)藥物理化性質，親水性藥物以細胞旁途徑，親脂性藥物以跨細胞途徑轉運通過BTB，并且跨細胞途徑能夠轉運與白蛋白大小相似或比其大的血漿蛋白。在正常BBB和BTB，腦微血管內皮細胞(BMECs)具有很低的胞吞轉運功能，限制了許多大分子和顆粒性藥物進入腦組織和

3、腫瘤組織。如何增加BMECs跨細胞轉運是增加化療藥物進入腫瘤組織、提高化療療效的關鍵。為了有效的轉運藥物進入腫瘤組織而不影響正常腦組織，需要尋找能夠選擇性開放BTB的策略，這既可以使治療藥物靶向進入腫瘤組織，提高藥物療效，又減少藥物對正常腦組織的毒副作用。 應用低頻超聲輻照在一定聲強控制下可非侵襲性、可逆性、選擇性開放BBB，而不損害輻照部位的腦組織。低頻超聲輻照能通過增加BMECs吞飲小泡的數(shù)量增強BBB的胞吞轉運功能，但是具

4、體的分子機制不清。 小劑量緩激肽(BK)頸內動脈灌注可以選擇性開放BTB，而不影響正常腦組織。BK主要是通過位于膠質瘤細胞的B2受體起作用：BK與B2受體結合后，增加細胞內Ca2+濃度，增高的細胞內Ca2+能激活一氧化氮合成酶(NOS)產生一氧化氮(NO)。NO進而激活可溶性鳥苷酸還化酶(sGC)，產生高濃度cGMP，引起吞飲小泡增加，使BTB通透性增加。 質膜微囊(Caveolae)是細胞質膜表面特異性的內陷囊狀結構，

5、是一種參與內皮細胞跨細胞轉運的細胞器，它的主要功能是轉運大分子物質或內化小分子物質進出細胞。Caveolins是caveolae的主要功能結構蛋白。在腦組織中，caveolin—1，2主要表達在BMECs中，caveolin—3主要表達于星形膠質細胞。Caveolin—1修飾于caveolae的內表面，是caveolae的標志性蛋白，在維持caveolae形態(tài)、結構、功能中起重要作用。Caveolin—2與caveolin—1有相同的組

6、織和細胞分布，caveolin—2對caveolin—1的結構維持，膜定位及調節(jié)caveolae的動力學方面有重要作用。Caveolin—1與caveolin—2形成穩(wěn)定的異源寡聚體復合物，共同定位于caveolae的質膜區(qū)域內，二者共同參與BMECs的胞吞轉運過程。 本研究首先確定低頻超聲輻照開放BBB，而沒有腦組織損傷的聲學參數(shù)，然后通過建立大鼠C6膠質瘤模型，應用組織學、分子生物學等方法，證明低頻超聲輻照通過增加BMECs

7、胞吞轉運選擇性開放BTB的分子機制，并且聯(lián)合應用小劑量BK以求最大限度增加BMECs胞吞飲轉運，為臨床靶向提高BMECs跨細胞途徑轉運藥物的治療策略提供理論基礎。 材料與方法： 1、低頻超聲輻照：德力凱公司EMS—900型腦超儀器(中國醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院腦功能檢查室)，探頭頻率1.0MHz，探頭直徑2.0cm，功率在一定范圍內可調。造影劑Optison在每一個輻照前10s經右股靜脈注入，注射容量為0.05ml/kg。

8、 2、超聲窗的制作(降低低頻超聲波的衰減，為了研究精確)：Wistar健康雌性大鼠，由中國醫(yī)科大學實驗動物中心提供，體重180～200g。術前10％水合氯醛(3.5ml/kg)腹腔注射麻醉，頭頂部皮膚用剪刀剪去，固定于立體定位儀上，正中矢狀切開約2cm切口，鈍性剝離骨膜，用牙科鉆以大鼠冠狀縫上中線右旁開3mm為中心各移去一塊顱骨(3×3mm)，將表皮覆蓋在骨窗并縫合上，5天后備用。 3、大鼠C6膠質瘤細胞的培養(yǎng)：含10％胎

9、牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)基，37℃，濕度100％，5％CO2條件下培養(yǎng)。 4、大鼠C6腦膠質瘤模型的制備：常規(guī)培養(yǎng)C6大鼠膠質瘤細胞，用不含胎牛的高糖DMEM培養(yǎng)基制備細胞懸液，濃度為1×106/10μl。腹腔注射10％的水合氯醛(3.5ml/kg體重)麻醉大鼠，在立體定位儀上用微量進樣器注入大鼠右側腦尾狀核10μl C6膠質瘤細胞懸液，靶點為冠狀縫前1 mm，矢狀縫右側旁開3mm，深4.5 mm。腫瘤細胞移植10-14天后備用

10、。 5、應用伊文思蘭(Evans blue，EB)和透射電鏡確定低頻超聲輻照開放BBB，沒有輻照部位腦組織損傷的聲學參數(shù)。 6、應用EB檢測低頻超聲輻照后不同時間點及聯(lián)合小劑量BK后BTB通透性變化。 7、透射電鏡觀察低頻超聲輻照后不同時間點及聯(lián)合小劑量BK后BTB中BMECs吞飲小泡數(shù)量的改變。 8、應用S-P免疫組織化學法和免疫熒光化學法檢測低頻超聲輻照后不同時間點及聯(lián)合小劑量BK后BTB中BMECs

11、質膜微囊結構蛋白caveolin—1和caveolin—2的分布和表達變化。 9、應用RT-PCR法和Western blot法檢測低頻超聲輻照后不同時間點及聯(lián)合小劑量BK后腫瘤組織中腦微血管段質膜微囊結構蛋白caveolin—1和caveolin—2的mRNA和蛋白表達變化。 10、建立體外BTB模型，應用免疫熒光化學法檢測低頻超聲輻照后BTB中BMECs質膜微囊結構蛋白caveolin—1和caveolin—2的蛋白

12、表達和分布改變。 結果： 1、應用低頻超聲輻照(頻率1.0MH，功率12mW，輻照時間20s)能夠選擇性開放BBB，未見輻照部位腦組織的損傷。 2、低頻超聲輻照后BTB的EB滲出量增加，BMECs吞飲小泡數(shù)量增加，輻照后1.5h EB滲出量最大，BMECs吞飲小泡最多，12h后EB滲出量和吞飲小泡數(shù)量恢復未輻照水平。 3、低頻超聲輻照后BTB中BMECs質膜微囊結構蛋白caveolin—1和caveoli

13、n—2的mRNA和蛋白表達升高，輻照后1.5h達峰值，12h后恢復未輻照水平。 4、體外BTB模型中，低頻超聲輻照后BMECs質膜微囊結構蛋白caveolin—1和caveolin—2表達明顯增加，輻照后1.5h達峰值，12h恢復原來水平，caveolin—1和caveolin—2蛋白的分布呈現(xiàn)由細胞膜到細胞質的分布改變過程。 5、低頻超聲輻照聯(lián)合小劑量BK與二者單獨應用相比能夠最大限度增加BTB的EB滲出，顯著增加BT

14、B中BMECs吞飲小泡的數(shù)量和質膜微囊結構蛋白caveolin—1和caveolin—2的mRNA和蛋白表達。 結論： 1、低頻超聲輻照(頻率1.0MHz，功率12mW，輻照時間20s)能夠選擇性開放血腦屏障。 2、低頻超聲輻照能夠增加BTB的EB滲出和BMECs吞飲小泡的數(shù)量通過跨細胞途徑增加BTB的通透性。 3、低頻超聲輻照能夠增加BTB中BMECs質膜微囊結構蛋白caveolin—1和caveoli

15、n—2的mRNA和蛋白表達。 4、低頻超聲輻照聯(lián)合小劑量BK與二者單獨應用相比顯著增加BTB的EB滲出和BMECs吞飲小泡的數(shù)量通過跨細胞途徑增加BTB的通透性。 5、低頻超聲輻照聯(lián)合小劑量BK與二者單獨應用相比顯著增加BTB中BMECs質膜微囊結構蛋白caveolin—1和caveolin—2的mRNA和蛋白表達。 6、質膜微囊結構蛋白caveolin—1，caveolin—2的表達水平上調可能是BMECs增加