腫瘤壞死因子alpha增加腸上皮細(xì)胞屏障通透性的機(jī)制研究.pdf

1、本文應(yīng)用Caco-2細(xì)胞株建立體外腸上皮細(xì)胞屏障模型，觀(guān)察TNFα對(duì)腸上皮細(xì)胞屏障通透性和腸上皮細(xì)胞間緊密連接的影響，并在此基礎(chǔ)上探討了TNFα對(duì)調(diào)控緊密連接裝配的蛋白酶活化受體．3/非典型蛋白激酶C/蛋白酶活化受體-6(Par-3/aPKC/Par-6)復(fù)合體的影響和可能信號(hào)通路，以明確病理?xiàng)l件下，TNFα增加腸上皮細(xì)胞屏障通透性的作用機(jī)制。 研究材料和方法： 1、體外腸上皮細(xì)胞屏障模型的建立。應(yīng)用Caco-2細(xì)胞株建

2、立體外腸上皮細(xì)胞屏障模型，并應(yīng)用跨上皮細(xì)胞電阻(TEER)和熒光黃透過(guò)率兩種指標(biāo)檢測(cè)腸上皮細(xì)胞屏障的形成情況。 2、TNFα對(duì)腸上皮細(xì)胞屏障通透性的影響。加入不同濃度的TNFα(10μg/L或100μg/L)作用24h或加入TNFα100μg/L作用不同時(shí)間(2、4、8、24h)，觀(guān)察加入TNFα前后Caco-2細(xì)胞屏障跨上皮細(xì)胞電阻的改變及TNFα對(duì)Caco-2細(xì)胞熒光黃透過(guò)率的影響。 3、TNFα對(duì)腸上皮細(xì)胞間緊密連

3、接的影響。透射電鏡下觀(guān)察加入TNFα100μg/L作用24h后，Caco-2細(xì)胞間緊密連接形態(tài)學(xué)的改變。 4、TNFα對(duì)腸上皮細(xì)胞緊密連接蛋白o(hù)ccludin定位和表達(dá)的影響。制備Caco-2細(xì)胞NP-40可溶性和NP-40不溶性蛋白框架，應(yīng)用蛋白印跡雜交(Westem blot)技術(shù)，檢測(cè)加入不同濃度的TNFα(10μg/L或100μg/L)作用24h后，不同蛋白框架內(nèi)腸上皮細(xì)胞緊密連接蛋白o(hù)ccludin表達(dá)的變化情況。并應(yīng)

4、用免疫熒光和實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)檢測(cè)occludin蛋白的定位和mRNA表達(dá)的變化情況。 5、TNFα對(duì)腸上皮細(xì)胞Par-3表達(dá)和定位的影響。加入TNFα100μg/L作用不同時(shí)間(0、4、8、24h)后，應(yīng)用免疫熒光、Westernblot和逆轉(zhuǎn)錄．聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)技術(shù)檢測(cè)TNFα對(duì)腸上皮細(xì)胞Par-3表達(dá)和定位的影響。 6、TNFα對(duì)腸上皮細(xì)胞非典型蛋白激酶C亞型PKCλ和PKCζ活性的影響。應(yīng)用抗PKCζ

5、/λ(17hr410/403)磷酸化抗體檢測(cè)加入TNFα100μg/L作用不同時(shí)間(0、4、8、 24h)后，PKCkλ/ζ活性的改變。 7、應(yīng)用免疫共沉淀的方法檢測(cè)Caco-2細(xì)胞內(nèi)與Par-3結(jié)合的信號(hào)分子。應(yīng)用抗Par-3抗體沉淀Caco-2細(xì)胞裂解產(chǎn)物，然后應(yīng)用抗T淋巴瘤侵襲轉(zhuǎn)移因子(Tiaml)抗體對(duì)沉淀產(chǎn)物進(jìn)行蛋白印跡雜交，明確Par-3是否與Tiaml結(jié)合。 8、TNFα對(duì)腸上皮細(xì)胞T淋巴瘤侵襲轉(zhuǎn)移因子表達(dá)

6、和定位的影響。加入TNFα100μg/L作用不同時(shí)間(0、4、8、24h)后，應(yīng)用免疫熒光、免疫電鏡、Western blot和RT-PCR技術(shù)檢測(cè)TNFα對(duì)腸上皮細(xì)胞Tiaml表達(dá)和定位的影響。 9、TNFa對(duì)腸上皮細(xì)胞Racl活性的影響。應(yīng)用配體免疫沉淀法檢測(cè)加入TNFα100μg/L作用不同時(shí)間(0、4、8、24h)后，Racl活性的改變。 10、Tiaml在TNFα降低緊密連接蛋白o(hù)ccludin表達(dá)中的作用。應(yīng)

7、用小核糖核酸干擾(siRNA)技術(shù)沉默Caco-2細(xì)胞內(nèi)Tiaml基因，觀(guān)察在Tiaml低表達(dá)的Caco-2細(xì)胞內(nèi)，TNFα對(duì)緊密連接蛋白o(hù)ccludin表達(dá)的影響。 研究結(jié)果： 1、TNFα增加腸上皮細(xì)胞屏障的通透性。與對(duì)照組相比，10μg/LTNFα即可降低腸上皮細(xì)胞屏障的TEER(P<0.0005)，增加熒光黃透過(guò)率(P<0.0005)，100μg/L TNFα這種作用更加明顯(P<0.0005)。在作用時(shí)間上，T

8、NFa100μg/L作用4h后，TEER值即開(kāi)始下降(P<0.0005)，熒光黃透過(guò)率開(kāi)始升高(P=0.001)，24h這種作用達(dá)到最強(qiáng)(P<0.0005)。 2、TNFα破壞腸上皮細(xì)胞間的緊密連接。正常CaCo-2細(xì)胞，緊密連接結(jié)構(gòu)完整，呈致密的帶狀結(jié)構(gòu)。加入TNFα100μg/L作用24h后，緊密連接斷裂，細(xì)胞間隙增寬。 3、TNFα引起腸上皮細(xì)胞緊密連接蛋白o(hù)ccludin的定位異常。正常Caco-2細(xì)胞，occl

9、udin蛋白沿細(xì)胞膜分布；加入TNFα10μg/L作用24h后，occludin蛋白呈鋸齒狀分布，并且熒光信號(hào)減弱；加入TNFα100μg/L作用24h后，鋸齒狀分布更加明顯，熒光信號(hào)進(jìn)一步減弱，并且在胞漿內(nèi)可見(jiàn)陽(yáng)性染色。 4、TNFα引起oeeludin蛋白磷酸化減少。與對(duì)照組比較，加入TNFα100μg/L作用24h后，NP-40不溶性蛋白框架內(nèi)occludin蛋白(即磷酸化occludin蛋白)的相對(duì)含量明顯減少(P=0.

10、016)，而NP-40可溶性蛋白框架內(nèi)occludin蛋白(即非磷酸化occludin蛋白)的相對(duì)含量沒(méi)有變化(P=0.99)。 5、TNFα不影響occludin mRNA的表達(dá)。與對(duì)照組比較，不同濃度的TNFα或TNFα作用不同時(shí)間，均不能引起occludinmRNA的明顯改變(P=0.85，P=0.99)。 6、TNFα不影響Par-3的表達(dá)和定位。正常Caco-2細(xì)胞，Par-3定位在細(xì)胞膜上，與緊密連接蛋白的定

11、位一致，加入TNFα不能改變Par-3蛋白的定位。Western blot和RT-PCR結(jié)果提示加入TNFα后，Par-3蛋白和mRNA的相對(duì)含量與正常對(duì)照組比較沒(méi)有差別(P=0.99，P=0.86)。 7、TNFα下調(diào)PKCλ/ζ活性。與正常對(duì)照組相比，TNF100αg/L作用8h后，PKCλ/ζ活性開(kāi)始下降(P=0.014)，24h達(dá)到最低(P=0.001)。 8、Par-3與Tiaml免疫共沉淀。應(yīng)用抗Tiaml抗

12、體對(duì)Par-3預(yù)沉淀產(chǎn)物進(jìn)行蛋白印跡雜交后，發(fā)現(xiàn)在170kDa處出現(xiàn)特異性蛋白條帶，證明在Caco-2細(xì)胞內(nèi)，Par-3與Tiaml結(jié)合。 9、TNFα增加Tiaml表達(dá)，促進(jìn)Tiaml活化。在正常Caco-2細(xì)胞，Tiaml分布在胞漿內(nèi)，加入TNFα100μg/L作用24h后，Tiaml向細(xì)胞膜轉(zhuǎn)移。Western blot和RT-PCR結(jié)果顯示，與正常對(duì)照組比較，TNFα100μg/L作用24h后，Tiaml蛋白和mRNA的

13、相對(duì)含量明顯升高(P=0.029，P=0.011)。 10、TNFα促進(jìn)Racl的活化。與正常對(duì)照組比較，加入TNFα后，總Racl的含量沒(méi)有明顯變化(P=0.99)。但活性Racl(GTP-Racl)的含量在TNFα100μg/L作用24h后明顯升高(P=0.002)。 11、Tiaml介導(dǎo)TNFα引起的緊密連接蛋白o(hù)ccludin磷酸化減少。在Tiaml正常表達(dá)的Caco-2細(xì)胞，TNFα可以引起occludin蛋白

14、磷酸化的減少，而在Tiaml低表達(dá)的Caco-2細(xì)胞，TNFα的這種作用消失，兩者相比有明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P=0.001)。 研究結(jié)論： 1、TNFα增加腸上皮細(xì)胞屏障的通透性。 2、TNFα破壞腸上皮細(xì)胞間的緊密連接，這是其增加腸上皮細(xì)胞屏障細(xì)胞旁通透性的作用位點(diǎn)。 3、TNFα引起緊密連接蛋白o(hù)ccludin的異常分布，使緊密連接蛋白o(hù)ccludin磷酸化減少，但不影響未磷酸化的occludin蛋白表

15、達(dá)。 4、TNFα不影響occludin mRNA的表達(dá)，提示TNFα對(duì)occludin的調(diào)節(jié)發(fā)生在蛋白水平，而不是轉(zhuǎn)錄水平。 5、TNFα不影響Par-3的表達(dá)和定位，但能使PKCλ/ζ的活性降低，提示TNFα對(duì)于調(diào)控緊密連接裝配的Par-3/aPKC/Par-6復(fù)合體的定位沒(méi)有影響，但能抑制Par-3/aPKC/Par-6復(fù)合體的功能。 6、Tianal-Racl是Par-3/aPKC/Par-6復(fù)合體的上游