SwiprosiN-1在血脈屏障通透性調節(jié)中的作用及機制研究.pdf

1、血腦屏障(Blood-brain barrier, BBB)，是指位于中樞神經(jīng)系統(tǒng)與外周血液循環(huán)之間由多種細胞與非細胞成分共同構成的血管組織結構，主要功能由腦微血管內皮細胞承載，其他種類細胞（如星形膠質細胞、周細胞、細胞外基質、小膠質細胞以及神經(jīng)元等）圍繞腦微血管周圍，共同輔助內皮細胞起作用。其主要的功能為限制物質進出中樞神經(jīng)系統(tǒng)，保持中樞神經(jīng)系統(tǒng)內部環(huán)境的穩(wěn)定性。血腦屏障通透性功能的破壞在幾乎所有的中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病中有所發(fā)生，這會導致

2、大量外周血液中的成分進入中樞神經(jīng)系統(tǒng)，進一步加劇疾病病程惡化。同時，研究如何可控的增加血腦屏障通透性，對于藥物到達中樞神經(jīng)系統(tǒng)，治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病具有重要意義。因此，尋找新型調節(jié)血腦屏障通透性的靶點具有重要意義。
　　研究目的:
　　我們課題組在大腦皮質中發(fā)現(xiàn)一種新型蛋白swiprosin-1，其主要集中表達于腦微血管內皮細胞中。Swiprosin-1是2004年首次報道發(fā)現(xiàn)的小分子量蛋白，目前關于該蛋白的研究主要集中見于

3、B淋巴細胞、T淋巴細胞等免疫細胞調節(jié)方面，該蛋白在其他方面作用知之甚少。腦微血管內皮細胞中過表達swiprosin-1后發(fā)現(xiàn)緊密連接蛋白ZO-1表達明顯減少，由于腦微血管內皮細胞是構成血腦屏障的結構基礎，緊密連接蛋白對內皮細胞通透性具有重要調節(jié)作用。據(jù)此，我們推測swiprosin-1在血腦屏障通透性調節(jié)過程中起到作用。本課題旨在研究swiprosin-1在血腦屏障通透性調節(jié)過程中如何發(fā)揮作用，明確其在血腦屏障通透性調節(jié)過程中的機制，為

4、進一步尋找調節(jié)血腦屏障通透性的新靶點奠定基礎。
　　內容與方法:
　　一、Swiprosin-1在腦皮質中的表達定位及其在不同動物模型中的表達差異
　　1.利用免疫印跡技術觀察swiprosin-1在正常小鼠全身不同組織器官中的表達含量;
　　2.利用免疫組織化學技術檢測swiprosin-1在大腦中表達分布情況;
　　3.體外培養(yǎng)大鼠腦微血管內皮細胞(BMEC)，利用免疫細胞化學技術檢測swiprosin

5、-1在其中表達分布;
　　4.制作三種增加血腦屏障通透性的動物模型:分別是大腦中動脈栓塞(MCAO)、LPS處理誘發(fā)全身性免疫反應、冷凍損傷，尾靜脈注射伊文思藍，體外直接觀察與熒光下檢測明確其血腦屏障功能破壞;
　　5.免疫熒光檢測三種動物模型中claudin-5、VE-cadherin、caveolin-1表達差異;
　　6.免疫印跡檢測三種血腦屏障通透性增加的動物模型中swiprosin-1表達變化;
　　7

6、.免疫印跡檢測BMEC缺糖缺氧(OGD)后swiprosin-1表達。
　　二、Swiprosin-1高表達與低表達對血腦屏障通透性的影響
　　1.構建swiprosin-1敲除小鼠，尾靜脈注射伊文思藍后，與野生型小鼠相比，兩組大腦中伊文思藍滲出差異;
　　2.構建swiprosin-1基因過表達小鼠，尾靜脈注射伊文思藍后，與野生型小鼠相比，熒光定性及定量比較兩組大腦中伊文思藍滲出差異;
　　3.對swipros

7、in-1基因敲除小鼠施行MCAO手術，術后22h尾靜脈注射伊文思藍，熒光定性和定量比較兩組大腦中伊文思藍滲出。
　　三、Swiprosin-1對血腦屏障通透性調節(jié)作用的機制研究
　　1.免疫組織熒光染色定性比較swiprosin-1過表達小鼠與野生型小鼠在生理狀況下緊密連接蛋白occludin、ZO-1分布;
　　2.免疫印跡定量比較swiprosin-1過表達小鼠與野生型小鼠在生理狀況下大腦皮質中緊密連接蛋白occl

8、udin、ZO-1及claudin-5表達;
　　3.免疫組織熒光染色定性比較swiprosin-1敲除鼠MCAO后梗死區(qū)與非梗死區(qū)緊密連接蛋白occludin、ZO-1分布表達，及伊文思藍浸潤區(qū)域;
　　4.免疫印跡定量比較swiprosin-1敲除鼠MCAO后梗死區(qū)與非梗死區(qū)緊密連接蛋白occludin、ZO-1表達;
　　5.免疫印跡檢測Swiprosin-1過表達小鼠大腦皮質中ROCK-1蛋白表達;
　　

9、6.免疫印跡檢測BMEC中過表達swiprosin-1后緊密連接蛋白ZO-1表達，以及給予ROCK-1抑制劑Y27632后ZO-1蛋白表達變化;
　　7.免疫印跡檢測Swiprosin-1敲除小鼠MCAO后，大腦皮質梗死區(qū)與對照區(qū)域ROCK-1表達;
　　8.免疫印跡檢測干擾swiprosin-1的BMEC中，OGD處理6h后ZO-1表達;
　　9.免疫印跡檢測OGD處理BMEC6h后，連接蛋白ZO-1、occludi

10、n表達變化，及給予Y27632后連接蛋白ZO-1及occludin表達變化;
　　10.免疫共沉淀檢測野生型小鼠腦皮質中swiprosin-1與ZO-1相互作用關系。
　　四、體外實驗探究swiprosin-1調節(jié)BMEC中緊密連接蛋白及骨架蛋白的作用
　　1.免疫熒光檢測BMEC中過表達swiprosin-1后occludin、ZO-1分布改變，及與給藥Y27632后分布改變;
　　2.免疫熒光檢測BMEC中過

11、表達swiprosin-1后claudin-5分布改變，及與給藥Y27632后分布改變;
　　3.免疫熒光檢測BMEC中過表達swiprosin-1后細胞骨架蛋白F-actin分布改變，及與給藥Y27632后分布改變;
　　4.免疫熒光檢測BMEC中OGD處理6h后ZO-1分布改變，及與給藥Y27632后ZO-1分布改變;
　　5.免疫熒光檢測BMEC中OGD處理6h后骨架蛋白F-actin分布，及與給藥Y27632后

12、F-actin分布改變。
　　五、Swiprosin-1對BMEC其他內皮細胞相關功能的影響
　　1.免疫熒光觀察BMEC中干擾swiprosin-1，OGD6h后細胞形態(tài);
　　2.BMEC過表達swiprosin-1后，細胞形態(tài)觀察及遷移活性定量檢測;
　　3.BMEC過表達swiprosin-1后，細胞小管新生能力定量檢測。
　　結果:
　　一、成功制作三種病理性增加血腦屏障通透性的動物模型并檢

13、測swiprosin-1表達
　　1.Swiprosin-1在全身多組織器官中存在表達，其中大腦、小腦、延髓、間腦等中樞神經(jīng)系統(tǒng)組織均表達;
　　2.Swiprosin-1主要分布于大腦皮質中的腦血管中;
　　3.原代BMEC表達swiprosin-1，且主要分布于胞質中;
　　4.成功制作了MCAO、LPS處理誘發(fā)全身性免疫反應、冷凍損傷三種增加血腦屏障通透性動物模型。模型動物尾靜脈注射伊文思藍后，整個腦組織可

14、見明顯藍色浸潤，切片熒光下可以檢測到紅色熒光;
　　5.三種動物模型中claudin-5、VE-cadherin表達均下調，caveolin-1表達上調;
　　6.三種血腦屏障通透性增加的動物模型中，大腦皮質swiprosin-1表達上調;
　　7.BMEC中OGD處理后swiprosin-1表達量隨著缺氧時間的延長而增加，1h后顯著上調，4h時表達最高，至6h達到穩(wěn)定。
　　二、Swiprosin-1影響血腦屏

15、障通透性
　　1.與野生型小鼠相比，swiprosin-1敲除鼠生理狀態(tài)下血腦屏障通透性無明顯變化;
　　2.與野生型小鼠相比，swiprosin-1過表達鼠生理狀態(tài)下血腦屏障通透性明顯增加;
　　3.與野生型小鼠相比，swiprosin-1敲除鼠MCAO術后伊文思藍滲出明顯減少。
　　三、Swiprosin-1通過緊密連接蛋白調節(jié)血腦屏障通透性
　　1.Swiprosin-1過表達小鼠大腦皮質血管中緊密連

16、接蛋白occludin、ZO-1不連續(xù)分布;
　　2.Swiprosin-1過表達小鼠大腦皮質中occludin、ZO-1表達減少，claudin-5表達不變;
　　3.與野生型小鼠相比，swiprosin-1敲除鼠MCAO術后腦梗死區(qū)域occludin、ZO-1分布更為完整，伊文思藍集中于血管內分布，腦實質中浸潤較少;
　　4.與野生型小鼠相比，swiprosin-1敲除鼠MCAO術后腦梗死區(qū)域occludin、ZO

17、-1表達降低程度減輕;
　　5.與野生型小鼠相比，Swiprosin-1過表達鼠大腦中ROCK-1含量顯著增高;
　　6.細胞水平，過表達swiprosin-1后，BMEC中ZO-1表達顯著降低;給予Y27632，ZO-1表達顯著增加;
　　7.Swiprosin-1野生型鼠MCAO術后，大腦皮質梗死區(qū)域ROCK-1表達顯著增加;在swiprosin-1敲除型鼠中，兩者無顯著差異;
　　8.與空白病毒組相比，BM

18、EC干擾swiprosin-1后，OGD處理6h時，ZO-1表達顯著增加;
　　9.BMEC中，OGD損傷6h后occludin、ZO-1表達顯著下調，給予Y27632可抑制OGD損傷造成的occludin、ZO-1表達下調;
　　10.Swiprosin-1野生型鼠腦皮質中swiprosin-1與ZO-1存在蛋白蛋白相互作用。
　　四、Swiprosin-1影響B(tài)MEC中緊密連接蛋白及骨架蛋白分布
　　1.BM

19、EC中過表達swiprosin-1后，緊密連接蛋白occludin、ZO-1分布連續(xù)性減弱，Y27632可抑制occludin、ZO-1分布連續(xù)性減弱;
　　2.BMEC中過表達swiprosin-1后，緊密連接蛋白claudin-5分布無明顯變化;
　　3.BMEC中過表達swiprosin-1后，細胞骨架蛋白F-actin分布趨向胞膜，Y27632可抑制F-actin分布趨向胞膜;
　　4.BMEC中OGD損傷6h

20、，后緊密連接蛋白ZO-1分布連續(xù)性破壞，Y27632可抑制ZO-1分布連續(xù)性破壞;
　　5.BMEC中OGD損傷6h后，細胞骨架蛋白F-actin分布趨向胞膜，Y27632可抑制F-actin分布趨向胞膜。
　　五、Swiprosin-1調節(jié)內皮細胞功能
　　1.BMEC中OGD損傷6h后，細胞形態(tài)雜亂，細胞皺縮明顯。Y27632可減弱此種刺激下細胞形態(tài)的改變;
　　2.BMEC中OGD損傷6h后，細胞形態(tài)改變明

21、顯，干擾swiprosin-1后可以減弱細胞形態(tài)改變;
　　3.BMEC中過表達swiprosin-1后，細胞胞體伸出偽足，提示遷移能力增強;
　　4.BMEC中過表達swipro sin-1后，細胞遷移能力增強;
　　5.BMEC中過表達swiprosin-1后，小管新生能力無明顯變化。
　　結論:
　　1.Swiprosin-1是影響血腦屏障通透性的一個重要蛋白;
　　2.Swiprosin-1主