喉鱗癌及癌前病變中PCDGF的作用研究.pdf

1、第一部分 喉鱗癌與癌前病變中PCDGF基因mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)及意義 目的畸胎瘤源性生長(zhǎng)因子(PCDGF)是新近發(fā)現(xiàn)的生長(zhǎng)因子，在腫瘤發(fā)生發(fā)展中起重要作用。至今，尚無(wú)研究關(guān)于鱗狀細(xì)胞癌，特別是喉癌的PCDGF表達(dá)狀態(tài)。本研究的目的是探討PCDGF與頭頸鱗癌發(fā)生發(fā)展的關(guān)系，從而衡量PCDGF的臨床價(jià)值。 方法檢測(cè)146例喉癌、108例成人乳頭狀瘤、41例喉粘膜白斑和10例正常喉部粘膜。利用實(shí)時(shí)定量PCR分析RNA表

2、達(dá)水平；用免疫組織化學(xué)分析蛋白表達(dá)和定位。 結(jié)果喉癌中PCDGF的RNA和蛋白質(zhì)水平比正常粘膜的顯著增高(P＜0.001，P＜0.001)。同時(shí)喉部癌前病變(乳頭狀瘤、粘膜白斑)中PCDGF的RNA和蛋白質(zhì)水平比正常粘膜的也明顯增高(P＜0.05，P＜0.05)。而喉部癌前病變(乳頭狀瘤、粘膜白斑)中PCDGF的RNA和蛋白質(zhì)水平比喉癌的明顯的低(P＜0.05，P＜0.05)。喉癌中PCDGF基因表達(dá)在各病理分級(jí)(χ2=3.84

3、；P＞0.05)和T分級(jí)(χ2=6.2，P＞0.05)之間差異無(wú)顯著性，而在是否有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(N0和N1)之間差異有顯著性意義(χ2=7.93；P＜0.05)。 結(jié)論P(yáng)CDGF是喉癌癌變過(guò)程中重要的自分泌生長(zhǎng)因子。我們的發(fā)現(xiàn)也提示PCDGF可能成為喉癌早期診斷、靶向治療和預(yù)后監(jiān)測(cè)的合理標(biāo)志物。 第二部分 PCDGF發(fā)卡狀siRNA表達(dá)載體對(duì)Hep-2喉鱗癌細(xì)胞系PCDGF的表達(dá)和功能的影響 目的RNAi是

4、現(xiàn)代研究基因功能和發(fā)展治療的有力的工具。本研究探討siRNA誘導(dǎo)的PCDGF沉默成為喉癌的一種全新的輔助治療手段的可能性。 方法構(gòu)建含2條shRNA的RNAi質(zhì)粒，通過(guò)脂質(zhì)體穩(wěn)定轉(zhuǎn)染PCDGFshRNA至喉鱗癌細(xì)胞系Hep-2，針對(duì)轉(zhuǎn)染前后細(xì)胞通過(guò)繪制生長(zhǎng)曲線測(cè)定生長(zhǎng)增殖；軟瓊脂克隆形成實(shí)驗(yàn)分析非錨著依賴性生長(zhǎng)能力；裸鼠移植瘤實(shí)驗(yàn)觀察致瘤性；利用流式細(xì)胞儀Annexin-Ⅴ-FITC和PI雙標(biāo)記法檢測(cè)凋亡。 結(jié)果siRN

5、APCDGF轉(zhuǎn)染的克隆的PCDGF的水平比對(duì)照組的明顯低(73.7％)。siRNAPCDGF轉(zhuǎn)染組細(xì)胞數(shù)在無(wú)血清培養(yǎng)基中比對(duì)照組少75.3％(P＜0.001)。在含有10％FBS培養(yǎng)基中比對(duì)照組減少51.9％(P＜0.001)。并表現(xiàn)出受損的軟瓊脂克隆形成能力(p＜0.001)，致瘤性顯著減弱：40％成瘤率相對(duì)于對(duì)照組100％成瘤率；腫瘤重量要輕87％(0.46±0.6和2.2±0.5g；P＜0.01)。凋亡細(xì)胞比例從轉(zhuǎn)染前的21.40

6、％上升到71.72％(n=3；p＜0.001)。 結(jié)論P(yáng)CDGF能正向調(diào)節(jié)喉癌細(xì)胞的增殖能力、非錨著依賴性克隆形成能力、裸鼠成瘤性和凋亡抵抗力。腫瘤要能發(fā)展，侵潤(rùn)轉(zhuǎn)移的腫瘤細(xì)胞必須能逃避因脫離其黏附的正常底物而引發(fā)的凋亡并能在新的基質(zhì)環(huán)境里保持高度的增殖活性。PCDGF很有可能參與喉癌致癌過(guò)程中這些獨(dú)立而相互促進(jìn)的事件。我們的工作使siRNA誘導(dǎo)的PCDGF沉默可能成為喉癌的一種全新的潛在的輔助治療手段。 第三部分

7、 喉組織原代培養(yǎng)系統(tǒng)的建立 目的很多腫瘤研究是以建立的細(xì)胞系為基礎(chǔ)進(jìn)行的。然而細(xì)胞系是在體外培養(yǎng)壓力下生長(zhǎng)的一個(gè)克隆，并不代表整個(gè)細(xì)胞群體。現(xiàn)已證實(shí)，原發(fā)腫瘤的短期培養(yǎng)對(duì)評(píng)估復(fù)雜的試驗(yàn)結(jié)果更為可靠。建立一種有效便捷的喉癌培養(yǎng)體系，能同時(shí)收獲腫瘤上皮細(xì)胞和腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞，能短時(shí)間收獲足夠多的活性高的細(xì)胞。更有利于腫瘤上皮與間質(zhì)的相互關(guān)系和化療藥物和放療的細(xì)胞特異性反應(yīng)的研究。 方法本實(shí)驗(yàn)在膠原酶法的基礎(chǔ)上作適當(dāng)?shù)母牧?/p>

8、，克服微生物污染、細(xì)胞活性低生長(zhǎng)緩慢、細(xì)胞不易純化、傳代困難。組織經(jīng)原代和傳代培養(yǎng)后，應(yīng)用相差顯微鏡、HE染色、免疫組織化學(xué)和電鏡來(lái)觀察和鑒定原代分離培養(yǎng)的細(xì)胞。結(jié)果相差顯微鏡觀察細(xì)胞活性好。上皮細(xì)胞成鋪路石樣；成纖維細(xì)胞成梭狀密集。免疫組織化學(xué)染色顯示上皮細(xì)胞角蛋白陽(yáng)性；成纖維細(xì)胞波形蛋白陽(yáng)性。投射電鏡顯示上皮細(xì)胞為惡性腫瘤細(xì)胞特征。 結(jié)論本實(shí)驗(yàn)采用的原代培養(yǎng)方法有效、便捷和經(jīng)濟(jì)?？梢垣@得活性好、純度高的細(xì)胞，為頭頸鱗癌的機(jī)制

9、研究提供了較為理想的細(xì)胞模型。 第四部分 喉組織成纖維細(xì)胞中PCDGF基因mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)及意義 目的PCDGF是腫瘤發(fā)生發(fā)展中新近發(fā)現(xiàn)的生長(zhǎng)因子。最近，越來(lái)越多的資料證明，在腫瘤發(fā)生中，腫瘤相關(guān)的基質(zhì)并不僅僅是被動(dòng)的反應(yīng)者，更是主動(dòng)的誘導(dǎo)者。至今，關(guān)于正常人類的成纖維細(xì)胞的PCDGF的表達(dá)尚無(wú)報(bào)道，且成纖維細(xì)胞分泌的PCDGF在致癌過(guò)程中的可能作用也不清楚。在此研究中，我們系統(tǒng)地檢測(cè)來(lái)源于喉癌、癌旁無(wú)癌組織

10、、正常喉組織和癌前病變(成人乳頭狀瘤)的成纖維細(xì)胞的PCDGF表達(dá)水平。 方法分別收集10例喉癌、相應(yīng)癌旁、成人乳頭狀瘤和正常喉部粘膜標(biāo)本。利用實(shí)時(shí)定量PCR和Western-blot法測(cè)細(xì)胞表達(dá)的PCDGF。通過(guò)第三部分建立的原代培養(yǎng)方法，我們還檢測(cè)了在體外持續(xù)培養(yǎng)的不同代數(shù)的成纖維細(xì)胞中的PCDGF的表達(dá)。結(jié)果在PCDGF的RNA表達(dá)和蛋白質(zhì)分泌水平方面，CAF比癌旁成纖維細(xì)胞(P＜0.01)、乳頭狀瘤成纖維細(xì)胞(P＜0.0

11、5)和正常喉成纖維細(xì)胞都明顯增高(P＜0.001)；乳頭狀瘤成纖維細(xì)胞比正常喉成纖維細(xì)胞也顯著增高(P＜0.05)；而癌旁成纖維細(xì)胞與正常喉成纖維細(xì)胞卻沒(méi)有顯著差異(P＞0.05)。CAF和乳頭狀瘤成纖維細(xì)胞的PCDGF表達(dá)水平都明顯增高。再者，第八代成纖維細(xì)胞的RNA和蛋白質(zhì)表達(dá)水平比第三代的明顯升高(p＜0.01，p＜0.01)。相反，在癌旁成纖維細(xì)胞與正常喉成纖維細(xì)胞，第八代成纖維細(xì)胞的RNA和蛋白質(zhì)表達(dá)水平與第三代的相比無(wú)顯著性