利用siRNA沉默PCNA研究對宮頸癌生長的影響.pdf

1、華中科技大學博士學位論文利用siRNA沉默PCNA研究對宮頸癌生長的影響姓名：黃浩申請學位級別：博士專業(yè)：病原生物學指導教師：黃漢菊20090501華中科技大學博士學位論文華中科技大學博士學位論文3HeLa細胞干預的影響。同時觀察其在體內(nèi)實驗中對腫瘤細胞表達PCNA的作用，為RNA干擾技術對腫瘤的基因治療提供了一定理論和實驗基礎。目的目的在了解增殖細胞核抗原的分子生物學及免疫學特性的基礎上，我們構建PCNA的shRNA的真核表達載體并在

2、HeLa細胞表達，觀察PCNA的shRNA對人HeLa細胞體外增殖的影響及生物學特性的改變。同時利用shRNA質(zhì)粒介導抑制人HeLa細胞表達PCNA，觀察其在體內(nèi)實驗中對裸鼠移植腫瘤生長的影響。方法方法1.根據(jù)PCNA的cDNA的序列設計shRNA的引物，插入真核表達載體pGenesil1構建真核表達質(zhì)粒pGenesil1PCNA14，并通過酶切和測序等方法進行鑒定，將真核表達質(zhì)粒pGenesil1PCNA14轉(zhuǎn)染人HeLa細胞，運用集

3、落形成試驗、單細胞凝膠電泳實驗觀察PCNA的shRNA對人HeLa細胞的生長抑制，免疫組化技術和westernblot檢測PCNA的蛋白表達，流式細胞儀分析細胞周期變化。2.裸鼠皮下注射HeLa細胞，待形成肉眼可見的皮下腫瘤后，隨機分組，分別于腫瘤組織周圍進行注射?？瞻讓φ战M注射生理鹽水；陰性對照組注射含無意義序列shRNA質(zhì)粒；PCNAshRNA組注射含PCNAshRNA質(zhì)粒；轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine2000組。將穩(wěn)定表達P

4、CNAshRNA與表達無意義序列shRNA的HeLa細胞，與未轉(zhuǎn)染HeLa細胞分別注射于裸鼠皮下，觀察腫瘤成瘤率以及腫瘤生長情況。分別剝離各組移植腫瘤，測量腫瘤組織勻漿上清液測總蛋白含量及PCNA含量。結果結果1.通過瞬時轉(zhuǎn)染PCNAshRNA，發(fā)現(xiàn)PCNA的shRNA能顯著抑制人HeLa細胞的生長，并促進細胞凋亡，阻滯細胞于G0G1—S期2.裸鼠腋部皮下分別注射未轉(zhuǎn)染、穩(wěn)定表達PCNAshRNA和無意義序列shRNA的HeLa細胞后，