PTEN基因抗白血病作用及其機(jī)制的研究.pdf

1、河北醫(yī)科大學(xué)博士學(xué)位論文PTEN基因抗白血病作用及其機(jī)制的研究姓名：成志勇申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別：博士專業(yè)：內(nèi)科學(xué)指導(dǎo)教師：潘崚20090401中文摘要檢測(cè)其可能的作用機(jī)制，為基因治療白血病提供理論依據(jù)。研究分以下三部分：第一部分腺病毒介導(dǎo)的野生型PTEN基因?qū)θ寺粤＜?xì)胞白血病細(xì)胞系K562及原代白血病細(xì)胞增殖、凋亡、細(xì)胞周期的影響目的探討腫瘤抑制基因PTEN對(duì)人原代白血病細(xì)胞及K562細(xì)胞系增殖、凋亡及細(xì)胞周期的影響，并對(duì)其可能的作用機(jī)制進(jìn)行

2、初步探討。方法將攜帶有野生型PTEN及綠色熒光蛋白的腺病毒(AdPTEN—GFP)或空載體腺病毒(AdGFP)轉(zhuǎn)染人原代白血病細(xì)胞及K562細(xì)胞系。MTT檢測(cè)細(xì)胞生長(zhǎng)曲線；流式細(xì)胞儀檢測(cè)腺病毒轉(zhuǎn)染細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率、細(xì)胞凋亡率和細(xì)胞周期分布；光鏡下檢測(cè)細(xì)胞形態(tài)變化，DNAladder，Hoechst33342熒光染色檢測(cè)、細(xì)胞集落形成等實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞增殖及凋亡。熒光定量PCR(FQPCR)檢測(cè)PTEN、Bcl2、BclxL、Bax、Survi

3、vin、Xiap、Smac、Caspase3、一7、一9、CyclinD1、CyclinD2、CDK4、P27叫mRNA水平變化，WesternBlot檢測(cè)PTEN、Bcl2、Akt、PAkt水平變化。Caspase活性檢測(cè)試劑盒檢測(cè)Caspase3／7、Caspase9蛋白活性。結(jié)果1當(dāng)MOI為200時(shí)，轉(zhuǎn)染第三天用流式細(xì)胞儀檢測(cè)腺病毒轉(zhuǎn)染K562細(xì)胞效率最高為81254％。通過(guò)計(jì)數(shù)綠色熒光細(xì)胞數(shù)量檢測(cè)轉(zhuǎn)染原代細(xì)胞效率較低，選取了5例

4、原代白血病細(xì)胞，平均轉(zhuǎn)染效率為732641％。2當(dāng)MOI為200時(shí)在轉(zhuǎn)染第3天PTENmRNA及蛋白表達(dá)水平達(dá)到最高。轉(zhuǎn)染后d3，AdPTENGFP組PTEN表達(dá)mRNA水平(2358士452)及蛋白表達(dá)水平(0912士0102)高于AdGFP組的mRNA(0650士0516)及蛋白(0117士0028)表達(dá)水平和未轉(zhuǎn)染對(duì)照組的mRNA(O575士0226)及蛋白(O0860021)表達(dá)水平，均P001。3AdPTENGFP以感染復(fù)數(shù)為

5、200轉(zhuǎn)染細(xì)胞后第5天與空載體腺病毒(AdGFP)相比，AdPTENGFP轉(zhuǎn)染人原代白血病細(xì)胞后，細(xì)胞增殖受抑，對(duì)轉(zhuǎn)染的5例原代細(xì)胞增殖抑制率為338104％。AdPTENGFP以感染復(fù)數(shù)為200轉(zhuǎn)染K562細(xì)胞后第5天，細(xì)胞最大生長(zhǎng)抑制率為3867％，明顯高于AdGFP組的抑制率534％。AdPTENGFP組細(xì)胞凋亡率為224士211％，明顯高于AdGFP組的28067％和未轉(zhuǎn)染組的02士002％，均P005。4腺病毒轉(zhuǎn)染K562細(xì)胞