高三尖杉酯堿抗急性髓系白血病作用的分子靶標鑒定及其作用機制研究.pdf

1、研究背景:
　　高三尖杉堿酯（Homoharringtonine，cephalotaxine，4-methyl2-hydroxy-4-meth-ylpentyl butanedioate[ester]，簡稱HHT，別名高粗榧堿）是從我國特有三尖杉屬植物海南粗榧（Cephalotaxus harringtonia）（常綠喬木）中分離得到的天然生物堿，在納摩爾（nanomolar concentration，nM）濃度就能殺傷腫瘤細胞

2、，是一種非常有效的抗癌劑。在中國，HHT被用來作為急性髓系白血病(acute myeloid leukemia, AML)聯(lián)合化療方案的一個關(guān)鍵組成部分，廣泛使用已經(jīng)超過30年。
　　最近的一項多中心、開放、隨機對照的Ⅲ期臨床試驗顯示，對于原發(fā)性AML患者，基于HHT的誘導(dǎo)方案HAA（高三尖杉酯堿+阿糖胞苷+阿柔比星）取得了較高(73％)的完全緩解率(complete remission rate，CR)，顯著高于目前治療AML的

3、國際標準方案（柔紅霉素聯(lián)合阿糖胞苷）的57.3％;并且其3年無事件生存率(3-yearevent-free survival)為35.4％比23.1％，從而成為原發(fā)性AML的標準誘導(dǎo)緩解方案。然而，臨床上不同白血病患者對HHT的治療反應(yīng)是迥然不同的。HHT對部分患者有良好的治療效果，能達到完全緩解，但也有一部分患者不但沒有收到療效，甚至出現(xiàn)了骨髓抑制等嚴重后果。因此，尋找HHT抗白血病作用的分子靶標，并闡明其作用的具體分子機制無疑有助于

4、最大限度發(fā)揮HHT抗白血病作用并減少HHT相關(guān)的毒副作用。
　　以往一些研究認為核糖體是HHT介導(dǎo)的蛋白質(zhì)翻譯抑制的候選靶標之一，其主要依據(jù)是晶體結(jié)構(gòu)研究。該研究顯示HHT與氨基酸側(cè)鏈的氨?；?tRNA相競爭，結(jié)合在核糖體的肽基轉(zhuǎn)移酶中心的A位。然而，在此共結(jié)晶結(jié)構(gòu)模型中使用的HHT濃度為1毫摩爾(mM)，這是HHT用于殺傷腫瘤細胞nM濃度的10萬倍，提示HHT結(jié)合到核糖體的親和力可能不高。不排除在這一高濃度下，HHT非特異性結(jié)合

5、到核糖體的可能。此外，如果核糖體是HHT的一個關(guān)鍵靶標，HHT處理后應(yīng)抑制全部蛋白質(zhì)的合成。然而，文獻研究發(fā)現(xiàn)HHT選擇性地抑制一些半衰期短的致癌蛋白的合成，如c-Myc，cyclin-D1，Mcl-1等，但對管家基因編碼的蛋白質(zhì)，如GAPDH和β-actin并沒有明顯影響，這是核糖體作為HHT的主要靶分子所不能解釋的。因此，我們推測尚有未知的關(guān)鍵的分子靶標可能參與HHT介導(dǎo)的抗腫瘤活性。
　　文獻報道指出，真核翻譯起始因子4E(

6、eukaryotic translation initiation factor4E，eIF4E)在具有短半衰期的致癌蛋白或者促生存蛋白的mRNAs轉(zhuǎn)運過程中發(fā)揮了關(guān)鍵性的作用;并且在AML-M5患者中eIF4E過表達。巧合的是，我們最近的研究發(fā)現(xiàn)p-eIF4E水平在AML-M5患者中高度上調(diào)。結(jié)合既往的研究結(jié)果，使我們有理由相信HHT可能通過作用于p-eIF4E發(fā)揮抑制白血病細胞增殖的作用。
　　本研究中，我們首先應(yīng)用生物素標記

7、的HHT分離和鑒定可能與HHT作用的eIF4E和p-eIF4E蛋白質(zhì)分子靶標，然后通過系列體外和小鼠體內(nèi)實驗手段和方法系統(tǒng)研究HHT與其靶標之間相互作用的分子機制，為明確HHT臨床應(yīng)用的適應(yīng)癥提供科學理論依據(jù)。
　　研究目的:
　　1、分離和鑒定高三尖杉堿酯抗急性髓系白血病作用的分子靶標;
　　2、初步闡明高三尖杉堿酯與其分子靶標p-eIF4E相互作用的分子機制;
　　3、明確高三尖杉堿酯對高表達分子靶標p-eI

8、F4E的人急性髓系白血病細胞在小鼠體內(nèi)的生長抑制作用;
　　4、明確高三尖杉堿酯分子靶標p-eIF4E在人髓系白血病原代樣本及正常血細胞樣本中的表達情況。
　　研究內(nèi)容與結(jié)果:
　　1.p-eIF4E是HHT抗急性髓系白血病活性的一個關(guān)鍵靶標
　　為了明確HHT是否特異性地影響AML細胞中的p-eIF4E水平，通過Westernblotting檢測HHT對p-eIF4E和t-eIF4E的作用。用HHT處理AML-

9、M5細胞系THP-1白血病細胞24小時導(dǎo)致p-eIF4E水平的抑制，呈劑量依賴，而t-eIF4E水平則不受影響。同樣，在原代AML細胞中也觀察到了類似結(jié)果。并且HHT對p-eIF4E水平的影響呈時間依賴。為觀察HHT是否存在抑制其他信號分子的脫靶效應(yīng)，我們檢測HHT對MNK1和Mcl-1的抑制作用。在顯著抑制eIF4E磷酸化的濃度，HHT對磷酸化的MNK1沒有明顯的影響，而Mcl-1的水平則表現(xiàn)出與p-eIF4E平行的下降，表明p-eI

10、F4E水平的下降不是非特異性毒性作用的結(jié)果。上述結(jié)果有力地表明HHT特異性地降低p-eIF4E及其下游靶蛋白Mcl-1。
　　為了評估HHT介導(dǎo)的p-eIF4E的減少是否與其抗白血病活性有關(guān)，通過MTT試驗和Western blotting技術(shù)來研究細胞存活率和p-eIF4E蛋白下降的關(guān)系。我們用一定濃度的HHT作用THP-1細胞48小時，可以觀察到HHT介導(dǎo)的抗白血病活性和p-eIF4E抑制呈正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為0.87。為了進一

11、步證實上述結(jié)果，接下來我們選擇了6個具有不同的抑制細胞增殖能力的HHT結(jié)構(gòu)類似物，分別檢測其在THP-1細胞的抗增殖活性和p-eIF4E的抑制作用，發(fā)現(xiàn)HHT類似物抗細胞增殖的IC50值和p-eIF4E的抑制是顯著相關(guān)的，相關(guān)系數(shù)為0.98。這些結(jié)果強有力地說明HHT可能是抑制白血病細胞生長的特異的p-eIF4E的拮抗劑。
　　2.HHT特異性下調(diào)白血病細胞p-eIF4E水平
　　為了確認上述實驗結(jié)果，我們采用生物素標記的H

12、HT(HHT-biotin)來捕獲白血病細胞中的p-eIF4E蛋白和eIF4E蛋白。采用THP-1細胞的全細胞裂解產(chǎn)物與HHT-biotin孵育，然后用親和素磁珠來沉淀與HHT-biotin相互作用的蛋白分子復(fù)合物。經(jīng)過充分的洗滌，在沉淀產(chǎn)物中檢測到p-eIF4E和t-eIF4E。與此相一致的是，我們通過SDS-PAGE和考馬斯亮藍染色實驗檢測到p-eIF4E蛋白條帶，并通過Western blotting和蛋白質(zhì)譜分析(Mass Sp

13、ectroscopic analysis)得到確認。為了檢測純化的p-eIF4E蛋白是否與HHT相互作用，進一步通過pull-down實驗證實HHT-biotin是結(jié)合到p-eIF4E蛋白的。
　　為了揭示在白血病細胞中HHT結(jié)合p-eIF4E的細胞定位，用生物素標記的HHT(HHT-biotin)、生物素(biotin)和HHT作用THP-1細胞12小時，通過p-eIF4E抗體的免疫熒光染色，觀察其與HHT-biotin的共定位

14、情況。結(jié)果顯示HHT-biotin在整個細胞漿和細胞核內(nèi)均有分布，但主要定位于核p-eIF4E。
　　為了進一步驗證上述實驗結(jié)果，我們用HHT(100 ng/ml)作用THP-1細胞12h或者24 h，通過免疫熒光染色來評估p-eIF4E和t-eIF4E在白血病細胞的分布。結(jié)果顯示HHT作用12小時，核p-eIF4E水平大大減少，在24小時基本消失，但t-eIF4E無明顯影響。并且我們還觀察到，伴隨核p-eIF4E的消失，HHT促

15、進核p-eIF4E在細胞核周邊和胞漿的聚集。Western blotting實驗也顯示HHT作用能顯著降低THP-1細胞核p-eIF4E水平。這些研究結(jié)果表明，在白血病細胞，HHT主要結(jié)合于p-eIF4E，特別是核p-eIF4E。
　　3.p-eIF4E209位磷酸化絲氨酸是HHT結(jié)合的關(guān)鍵位點之一
　　為了揭示HHT結(jié)合p-eIF4E的潛在結(jié)合位點，通過計算機分子對接模型，我們發(fā)現(xiàn)201a.a.到212a.a.是HHT結(jié)合

16、eIF4E的關(guān)鍵位點。我們模擬了25納秒(ns)時磷酸化S209(p-eIF4E)、磷酸化S209-敲除(eIF4E-Δ209S)與HHT的相互作用，結(jié)果顯示為了獲得更強的蛋白-配體相互作用，p-eIF4E中的環(huán)區(qū)移向HHT分子，K206的重要組成部分氧原子與HHT分子形成氫鍵。另一方面，在eIF4E-Δ209S內(nèi)的環(huán)區(qū)因為局部螺旋的形成而失去其靈活性，因此它與HHT分子的結(jié)合力是比較弱的。這可以通過檢查環(huán)區(qū)與HHT的最小距離來進一步說

17、明。模擬p-eIF4E、eIF4E和eIF4EΔ209S在0-25ns與HHT的相互作用，我們發(fā)現(xiàn)這個環(huán)區(qū)是靈活的，并且最終在17ns時p-eIF4E與HHT形成緊密而穩(wěn)定的作用，兩者的最小距離為2.8(A);然而對于eIF4E-Δ209S的模擬顯示，該環(huán)區(qū)始終遠離HHT分子，距離達到8(A);對于eIF4E，也沒有觀察到其與HHT穩(wěn)定的相互作用。上述分子對接模型結(jié)果表明，相比于eIF4E-Δ209S和eIF4E，p-eIF4E蛋白對H

18、HT具有更大的親和力。
　　為了鑒定HHT結(jié)合eIF4E的具體氨基酸位點，我們構(gòu)建了一系列eIF4E的突變體，包括W56，W73，W102和Ser209缺失的突變體，通過轉(zhuǎn)染HEK293細胞檢測HHT結(jié)合到這些突變體的能力。選擇這些突變體的主要原因是W73與泛素/降解相關(guān)，W56和W102涉及帽結(jié)合活性，而S209則是其磷酸化位點。結(jié)果顯示，Ser209缺失的突變體消除了eIF4E與HHT的結(jié)合，這與上述計算機模擬結(jié)果一致，而其他

19、氨基酸殘基的突變，包括eIF4E56W，73W和102W缺失，并不影響eIF4E與HHT的結(jié)合。這些結(jié)果表明磷酸化Ser209位點是HHT結(jié)合eIF4E的關(guān)鍵，并且p-eIF4E與HHT結(jié)合的親和力遠高于eIF4E。
　　4.HHT通過增加SUMO化促進蛋白酶體依賴的p-eIF4E蛋白降解
　　已知eIF4E是小泛素化蛋白(SUMO)底物之一。為明確SUMO化修飾是否參與HHT介導(dǎo)的p-eIF4E的下降，我們評估了白血病細胞

20、中HHT對p-eIF4E和SUMO結(jié)合酶UBC9的影響。結(jié)果顯示，HHT處理THP-1細胞3小時，p-eIF4E從細胞裂解液的上清轉(zhuǎn)移到不溶性顆粒，伴隨出現(xiàn)UBC9的增加。HHT處理24小時后，大部分的p-eIF4E從上清液轉(zhuǎn)移到不溶性顆粒，提示HHT增加p-eIF4E在髓系白血病細胞中的變性水平。這些結(jié)果與免疫熒光觀察到的結(jié)果即HHT誘導(dǎo)p-eIF4E在細胞核周邊和胞漿的聚集相一致。進一步，我們發(fā)現(xiàn)蛋白酶體抑制劑MG132強烈阻止白血

21、病細胞中HHT誘導(dǎo)的p-eIF4E蛋白水平的下降，提示HHT可能觸發(fā)p-eIF4E的蛋白酶體依賴的降解。
　　接下來我們研究HHT是否通過增加SUMO化使p-eIF4E變性？使用HEK293細胞轉(zhuǎn)染表達FALG-eIF4E、FALG-eIF4E-Δ209S的質(zhì)粒，然后用/不用HHT處理12h。細胞裂解物用抗FALG M2磁珠進行免疫沉淀，隨后用anti-SUMO1、anti-SUMO2/3或者anti-FALG抗體通過wester

22、n blotting技術(shù)進行分析。結(jié)果顯示:HHT處理后，用anti-SUMO2/3抗體檢測，發(fā)現(xiàn)野生型eIF4E在25 kDa以上有多條條帶，但是在eIF4E-Δ209S突變卻未檢測到;而且無法用anti-SUMO1抗體檢測到上述條帶，并且HHT(100 ng/ml)增加了SUMO化p-eIF4E的寡聚化。這些結(jié)果表明HHT處理增加了SUMO2/3介導(dǎo)的p-eIF4E的SUMO化。
　　此外，Ser209的磷酸化是HHT介導(dǎo)的p

23、-eIF4E的SUMO化的關(guān)鍵。為了進一步明確上述結(jié)果，在白血病細胞中，我們對HHT誘導(dǎo)的UBC9結(jié)合到p-eIF4E的水平做進一步的分析，發(fā)現(xiàn)HHT增加UBC9結(jié)合到p-eIF4E，呈時間依賴。這些結(jié)果表明，HHT誘導(dǎo)SUMO2/3分子介導(dǎo)的p-eIF4E蛋白的SUMO化，通過增加UBC9與p-eIF4E的親和力，這反過來導(dǎo)致p-eIF4E蛋白酶體依賴的降解。因此，我們提出HHT誘導(dǎo)p-eIF4E降解的工作模型:HHT特異性結(jié)合到p-

24、eIF4E的201-212a.a.，導(dǎo)致構(gòu)象變化，這有利于p-eIF4E的寡聚化和SUMO化，最終導(dǎo)致蛋白酶體依賴的降解。
　　5.HHT對p-eIF4E高表達的人AML-M5原位小鼠移植瘤的生長抑制作用
　　為了獲得HHT根除p-eIF4E高表達的AML細胞的體內(nèi)證據(jù)，我們把表達高水平p-eIF4E的THP-1細胞注射到NSG小鼠體內(nèi)，建立了具有侵襲性的人AML-M5原位小鼠模型。每天按0.5mg或1.0mg/kg體重的H

25、HT劑量腹腔給藥，1天1次，連續(xù)14天。經(jīng)過HHT處理大大降低了白血病負荷，并且生存時間延長，呈現(xiàn)劑量依賴。用高劑量HHT(1.0mg/kg體重)可以完全根除小鼠體內(nèi)的AML-M5細胞，且到80天時所有小鼠仍處于無病生存。這些結(jié)果表明HHT結(jié)合于p-eIF4E，使其具有根除表達高水平p-eIF4E的AML的潛能。
　　6.p-eIF4E在部分AML患者中異常上調(diào)，而在正常個體中未見表達或低表達
　　已有文獻指出eIF4E在部

26、分白血病患者中是高表達的，但p-eIF4E在人急性髓系白血病患者中是否表達目前未見任何報道。因此，我們通過western blotting技術(shù)檢測了7例人AML細胞系，16例不同的AML原代樣本，20例健康成年捐贈的正常造血細胞樣品中的p-eIF4E和eIF4E蛋白水平。結(jié)果顯示7例AML細胞均表達高水平的p-eIF4E和eIF4E蛋白，16例原代樣本中有13例(81.25％)表達高水平的p-eIF4E和eIF4E蛋白，但在20例健康成

27、年中，8例表達低水平的p-eIF4E蛋白，12例不表達p-eIF4E蛋白。上述結(jié)果表明，相比于正常個體，p-eIF4E蛋白水平在部分AML患者中是高度上調(diào)的。
　　研究結(jié)論:
　　1.p-eIF4E是HHT抗急性髓系白血病作用的重要靶標之一;
　　2.p-eIF4E絲氨酸209位磷酸化是HHT結(jié)合的關(guān)鍵位點之一;
　　3.HHT通過增強SUMO化途徑促進p-eIF4E進行蛋白酶體依賴的降解;
　　4.HHT