SHIP基因在白血病發(fā)病機制中作用的研究.pdf

1、背景：白血病是原發(fā)于造血系統(tǒng)的惡性腫瘤。近年來，其發(fā)病率呈增加趨勢。在35歲以下人群中，白血病的死亡率占惡性腫瘤第一位，嚴重危害中青年人的生命，所以值得特別重視。急性白血病的發(fā)生包括了復雜的基因突變、缺失、癌基因激活及抑癌基因失活等多種分子生物學水平的異常。盡管許多基因在白血病發(fā)病中的作用及其機制已初步明確，但所有的基因異常仍不能解釋全部白血病的發(fā)生機制，因此，尋找新的白血病相關(guān)基因并研究其生物學功能一直是白血病研究領(lǐng)域的熱點之一，不僅

2、有助于闡明白血病發(fā)生發(fā)展的機制，而且可能找到一些治療靶位點。
　　 SHIP基因是繼PTEN之后發(fā)現(xiàn)的僅在造血細胞表達的一種新的肌醇磷酸酶，其主要功能是降解PIP3成為PI3，4P2而負調(diào)控PI3K/Akt路徑。本課題組多年來一直圍繞SHIP基因功能與白血病發(fā)生發(fā)展關(guān)系開展研究工作，取得了一系列有意義的研究成果。首次報道急性白血病患者存在SHIP基因突變，并證實SHIP基因低表達和表達缺失與人白血病細胞惡性增殖密切相關(guān)，通過干擾

3、RNA封閉K562細胞的bcr/abl融合基因使SHIP蛋白重新表達并可以逆轉(zhuǎn)細胞的異常增殖表型，近年來也陸續(xù)發(fā)現(xiàn)和報道了一些白血病細胞中新的SHIP基因突變。這些都提示SHIP基因具有調(diào)控白血病細胞增殖、凋亡的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。但是，有關(guān)SHIP基因調(diào)控白血病細胞系K562的PI3K/Akt信號傳導通路的分子機理及其在抑制和/或逆轉(zhuǎn)K562細胞增殖能力中的地位，以及SHIP基因突變對P13K/Akt的調(diào)控有何改變等問題，目前國內(nèi)外均無報道。本

4、研究的目的是：（1）探討野生型SHIP基因?qū)θ税籽〖毎礙562中PI3K/Akt信號通路相關(guān)蛋白表達水平的影響；（2）構(gòu)建攜帶突變型SHIP基因的慢病毒載體并轉(zhuǎn)染K562細胞系；（3）探討SHIP基因突變后在K562細胞中的功能變化，為進一步研究SHIP基因在白血病發(fā)病機制中的作用提供實驗依據(jù)。
　　 第一部分野生型SHIP基因?qū)Π籽〖毎礙562增殖凋亡的實驗研究
　　 目的:探討肌醇5，磷酸酶基因SHIP對人白

5、血病細胞系K562增殖、凋亡及細胞周期的影響，并對其可能的作用機制進行初步探討。
　　 方法:將攜帶有野生型SHIP基因和空載體的慢病毒表達載體轉(zhuǎn)染人白血病細胞系K562。MTT檢測細胞生長情況；流式細胞儀檢測細胞轉(zhuǎn)染效率和細胞周期分布；顯微鏡及透射電鏡下觀察細胞形態(tài)及超微結(jié)構(gòu)改變，TUNEL、Hoechst33342熒光染色、細胞集落形成等實驗檢測細胞增殖及凋亡情況。實時熒光定量PCR（FQ-PCR）檢測轉(zhuǎn)染前后SHIP mR

6、NA表達變化，Western Blot檢測各轉(zhuǎn)染組SHIP、Akt、p-Akt308、p-Akt473、Bcl-2、Bax、Bad、Bcl-xL、CyclinD1、p27kip1、p21WAF1、NFκB蛋白水平變化。Caspase活性檢測試劑盒檢測Caspase-3、Caspase-9活性。NFκB活性檢測試劑盒檢測NFκB活性變化。
　　 結(jié)論:過表達野生型SHIP基因明顯抑制白血病細胞系K562增殖，促進K562細胞凋亡，

7、其機制可能通過抑制Akt磷酸化，進一步影響其下游與多種凋亡相關(guān)分子家族蛋白如Bcl-2家族、Caspase家族表達，并通過調(diào)控細胞周期相關(guān)蛋白表達使細胞周期阻滯在G0/G1期。
　　 第二部分 SHIP基因突變體的構(gòu)建
　　 目的:急性白血病患者存在SHIP基因突變，可能與白血病發(fā)病有關(guān)，構(gòu)建SHIP基因突變體（muSHIPP28L），為研究突變基因的表達和功能與白血病的發(fā)病機制奠定基礎(chǔ)。
　　 方法:以重組表達

8、質(zhì)粒wtSHIP為模板，用Stratagen Mutant Kit試劑盒通過PCR定點突變技術(shù)對SHIP編碼序列TTC進行定點突變→CTC，突變體經(jīng)測序鑒定正確，連接到慢病毒載體Receiver-Lv31（ORF不帶標簽）。經(jīng)重組慢病毒包裝，病毒滴度測定，感染K562細胞，采用FO-PCR和Western blot方法檢測SHIP mRNA和蛋白表達。
　　 結(jié)論:運用基因定點突變基因重組技術(shù)成功構(gòu)建了SHIP基因P28L突變體

9、，為進一步探討SHIP基因與白血病發(fā)病機制創(chuàng)造條件。
　　 第三部分 SHIP基因突變體在白血病細胞系K562細胞中的表達及其功能的研究
　　 目的:將構(gòu)建的SHIP基因突變體穩(wěn)定表達于人白血病細胞系K562中，觀察SHIP基因突變后在K562細胞中的功能變化，為進一步研究SHIP基因在白血病發(fā)病機制中的作用提供實驗依據(jù)。
　　 方法:FQ-PCR和Western blot鑒定野生型和突變型SHIP基因在K562

10、細胞中的表達；MTT比較K562/wtSHIP和K562/muSHIP兩組細胞生長情況；流式細胞分析比較野生型和突變型SHIP基因?qū)毎芷诘牟煌绊?；Hoechst33342熒光染色比較細胞凋亡情況。Western Blot比較轉(zhuǎn)染野生型和突變型SHIP基因后對K562細胞Akt、p-Akt308、p-Akt473、Bcl-2、Bax、Bad、Bcl-xL、CyclinDl、p27kip1、p21WAF1、NFκB蛋白表達的調(diào)控。Ca

11、spase活性檢測試劑盒檢測各組Caspase-3、Caspase-9活性。利用高壓液相色譜分析比較各轉(zhuǎn)染組PIP3和PI3，4P2水平。
　　 結(jié)論:
　　 1.SHIP基因突變體SHIPP28L導致其增殖抑制及促凋亡功能喪失。
　　 2.與野生型SHIP基因相比，SHIPP28L突變體導致其對K562細胞caspase-3、caspase-9和NF-κB活性的調(diào)節(jié)作用丟失。
　　 3.SHIP基因調(diào)控