蟾蜍甾烯類成分去乙?；A蟾毒精的Ⅱ相葡萄糖醛酸化代謝研究.pdf

1、目的:本論文選用中藥蟾酥中的重要活性成分去乙?；A蟾毒精(DACB)進行體外葡萄糖醛酸化代謝研究，以闡明其代謝特點，明確代謝產物的化學結構，揭示主要參與代謝的尿苷二磷酸葡萄糖醛酸化轉移酶(UGTs)單酶亞型，闡明其UGT代謝動力學及相關參數，以及UGT代謝種屬差異，詮釋不同羥基位點對于UGT代謝的影響。
　　方法:(1)體外代謝實驗:運用體外肝微粒體孵育法，通過人肝微粒體(Humanliver microsomes，HLM)、人腸

2、微粒體(Human intesstine microsomes，HIM)和14種重組單酶亞型及常用實驗動物肝微粒體(豬PLM、狗DLM、猴MLM、大鼠RtLM、小鼠MsLM、兔RLM、豚鼠TLM)對去乙酰基華蟾毒精的代謝進行代謝酶歸屬、動力學模型和表觀動力學參數的確定、以及比較代謝種屬差異;(2)利用體外代謝孵育制備代謝產物、天然藥物化學的分離、純化方法（制備HPLC等）和波譜學手段(NMR、LC-MS)，鑒定代謝產物學結構，確定底物代

3、謝位點;(3)利用Western Blotting方法，確定12例不同人肝微粒體中參與代謝單酶亞型的表達量，并與12例人肝微粒體的反應速率進行相關性分析，進一步確定單酶亞型的專屬性。
　　結果:去乙?；A蟾毒精在人肝微粒體中代謝生成兩個單葡萄糖醛酸化產物，即DACB-3-O-葡萄糖醛酸化產物(M-1)和DACB-16-O-葡萄糖醛酸化產物(M-2)，由單酶歸屬、抑制實驗結果可知，M-1由UGT1A4催化代謝生成，專屬性佳;M-2由

4、UGT1A1和UGT1A3催化生成，其中UGT1A3占主導地位。由動力學分析發(fā)現(xiàn):M-1在HLM和UGT1A4中的代謝遵循經典米氏動力學;M-2在HLM，HIM，UGT1 A3中的代謝遵循底物抑制動力學，在UGT1A1中的代謝遵循米氏動力學，并得到了相關的表觀動力學參數(Vmax，Km，Ki和CLint);同時，不同種屬的動物肝微粒體對DACB的代謝分析表明:狗、猴、兔、豚鼠肝微粒體中，M-1的代謝生成較多，根據動力學分析結果，確定猴可

5、作為研究M-1代謝生成的體內代謝模型動物;豬、狗、猴、兔肝微粒體中M-2的代謝比較迅速，動力學分析表明，兔子可以作為研究M-2代謝生成的體內代謝實驗模型動物。另外運用了Western Blotting方法也論證了單酶參與DACB代謝的專屬性。根據單酶歸屬結果、動力學分析、相關性分析和化學抑制實驗，可以確定DACB可作為UGTA3和UGT1 A4的探針底物。
　　結論:本論文首次對去乙酰基華蟾毒精在不同臟器、不同種屬微粒體及單酶亞型