天然酚類物質(zhì)的葡萄糖醛酸化代謝及代謝物外排研究.pdf

1、目的：
　　天然酚類物質(zhì)具有抗氧化、抗炎及抗腫瘤等多種藥理活性，是一類極具藥物開發(fā)潛力的化合物。然而，該類化合物體內(nèi)顯效形式和機制尚不明確。因此，闡明其體內(nèi)代謝及處置過程極為重要。本論文將評價葡萄糖醛酸轉(zhuǎn)移酶（UGTs）在天然酚類化合物體內(nèi)處置中的作用，闡明代謝調(diào)控的作用機制，為明確該類物質(zhì)體內(nèi)藥效物質(zhì)基礎(chǔ)提供科學(xué)依據(jù)。具體研究目標(biāo)如下：（1）測定兩種酚類化合物（辣椒素和補骨脂定）的UGT代謝活性；（2）評價外排轉(zhuǎn)運體【如乳腺癌耐

2、藥蛋白（BCRP）和多藥耐藥相關(guān)蛋白（MRPs）】在 UGT代謝物胞外轉(zhuǎn)運中的作用；（3）考察外排轉(zhuǎn)運體對 UGT代謝的調(diào)控效應(yīng)；（4）闡明外排轉(zhuǎn)運體調(diào)控UGT代謝的作用機制。
　　方法：
　　1.采用酶孵育法，分別測定辣椒素和補骨脂定在微粒體以及各 UGT亞型酶中的代謝活性。并通過相關(guān)性分析及活性相關(guān)因子法（RAF），確定代謝辣椒素和補骨脂定的主要UGT亞型酶。
　　2.采用慢病毒轉(zhuǎn)染技術(shù)，構(gòu)建UGT1A1酶高表達的

3、HeLa細胞株（簡稱為HeLa1A1細胞）。使用化學(xué)抑制法（即BCRP抑制劑Ko143、MRPs抑制劑MK-571）及生物抑制法（shRNA介導(dǎo)的基因沉默），考察外排轉(zhuǎn)運體在UGT代謝物外排中的作用。
　　3.采用慢病毒轉(zhuǎn)染 shRNA技術(shù)，構(gòu)建單一外排轉(zhuǎn)運體（BCRP、MRP1、MRP3和MRP4）低表達的HeLa1A1細胞株（簡稱為 HeLa1A1-BCRP-shRNA、HeLa1A1-MRP1-shRNA、HeLa1A1-M

4、RP3-shRNA和HeLa1A1-MRP4-shRNA）。測定三種酚類化合物（染料木素、芹菜素和大黃素）在上述細胞株中的總代謝程度——fmet，考察外排轉(zhuǎn)運體對UGT代謝的調(diào)控效應(yīng)。
　　4.基于HeLa1A1和HeLa1A1-MRP4-shRNA細胞模型，以染料木素和芹菜素為模型化合物，測定不同時間點的代謝物外排速率及胞內(nèi)蓄積。構(gòu)建二室藥代動力學(xué)模型，模型中引入UGT代謝、轉(zhuǎn)運以及去葡萄糖醛酸化反應(yīng)等過程。將此模型與藥動學(xué)實驗

5、數(shù)據(jù)進行擬合，評價去葡萄糖醛酸化反應(yīng)（即無效循環(huán)）在外排調(diào)控UGT代謝中的作用。
　　結(jié)果：
　　1.辣椒素和補骨脂定易被UGT酶代謝
　　（a）辣椒素在人肝微粒體（HLM）中發(fā)生 UGT代謝，代謝辣椒素的亞型有UGT1A1、1A3、1A7、1A8、1A9、2B7、2B15和2B17。辣椒素代謝速率與UGT1A1蛋白水平以及β-雌二醇（UGT1A1特異性底物）代謝速率呈顯著性相關(guān)（P<0.05）。同時，辣椒素代謝速率與

6、 UGT2B7蛋白水平以及齊多夫定（UGT2B7特異性底物）代謝速率也具有顯著相關(guān)性（P<0.01）。此外，UGT1A1和2B7對辣椒素代謝的貢獻率分別為30.3％和49.0%。上述結(jié)果表明，UGT1A1和2B7是代謝辣椒素的主要亞型酶。
　　（b）補骨脂定在HLM中發(fā)生UGT代謝，產(chǎn)生兩個代謝物（即9-O-G和3-O-G）。參與補骨脂定代謝的亞型酶有UGT1A1、1A7、1A8和1A9。其中，僅UGT1A9介導(dǎo)3-O-G的產(chǎn)生，

7、提示UGT1A9特異性催化補骨脂定（3-OH）的代謝，3-O-G可能為UGT1A9活性的標(biāo)記物。抑制HLM中UGT1A9的活性，能顯著抑制補骨脂定（3-OH）的代謝。補骨脂定（3-OH）代謝速率與UGT1A9蛋白水平及丙泊酚（UGT1A9特異性底物）代謝速率具有顯著相關(guān)性（p<0.001）。此外，UGT1A9在補骨脂定（3-OH）代謝中的貢獻率為99.6%。以上結(jié)果表明，補骨脂定（3-OH的代謝）可以作為UGT1A9的標(biāo)記性底物。

8、>　　2.外排轉(zhuǎn)運體BCRP和MRPs在UGT代謝物外排中起重要作用
　　成功構(gòu)建了HeLa1A1細胞株。白楊素在該細胞株中能發(fā)生UGT代謝。抑制BCRP和MRPs的活性，能顯著降低代謝物外排速率和清除率（p<0.01）。降低單一外排轉(zhuǎn)運體（BCRP、MRP1、MRP3和MRP4）的表達量，同樣導(dǎo)致代謝物外排速率和清除率顯著降低（p<0.01）。說明，BCRP、MRP1、MRP3和MRP4介導(dǎo)UGT代謝物的外排。
　　3.外

9、排轉(zhuǎn)運體對UGT代謝具有調(diào)控效應(yīng)
　　成功構(gòu)建了單一轉(zhuǎn)運體低表達的HeLa1A1-BCRP-shRNA、HeLa1A1-MRP1-shRNA、HeLa1A1-MRP3-shRNA和HeLa1A1-MRP4-shRNA細胞株。對比HeLa1A1細胞，染料木素、芹菜素和大黃素在上述細胞株中的代謝程度以及代謝物外排速率均顯著下降（p<0.01）。此結(jié)果提示，外排轉(zhuǎn)運體是影響UGT代謝的關(guān)鍵因素，BCRP、MRP1、MRP3和MRP4可以

10、調(diào)控細胞內(nèi)的UGT代謝。
　　4.無效循環(huán)可能為外排轉(zhuǎn)運體調(diào)控UGT代謝的主要作用機制
　　與 HeLa1A1細胞相比，染料木素和芹菜素在 HeLa1A1-MRP4-shRNA細胞中的總代謝程度和代謝物外排速率均顯著降低（P<0.01）。當(dāng)引入無效循環(huán)過程時，模型與藥動學(xué)實驗數(shù)據(jù)擬合度高。擬合結(jié)果提示，無效循環(huán)為外排轉(zhuǎn)運體調(diào)控UGT代謝的作用機制。
　　結(jié)論：
　　1.辣椒素和補骨脂定易被UGT酶代謝。主要負責(zé)辣