糖基化對(duì)β-D-葡萄糖醛酸苷酶催化特性及構(gòu)象的影響.pdf

1、糖基化是一種重要的蛋白質(zhì)翻譯后修飾方式,對(duì)蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能有著重要影響。本文以課題組前期構(gòu)建的三種不同糖基化類型表達(dá)系統(tǒng)(產(chǎn)紫青霉P.purpurogenum Li-3自然進(jìn)化糖基化型、大腸桿菌無(wú)糖基化型和畢赤巴斯德酵母高甘露糖糖基化型)表達(dá)的β-D-葡萄糖醛酸苷酶為對(duì)象,對(duì)不同系統(tǒng)表達(dá)的β-D-葡萄糖醛酸苷酶進(jìn)行分離純化；確定β-D-葡萄糖醛酸苷酶在不同表達(dá)系統(tǒng)中的糖基化水平；研究不同糖基化水平β-D-葡萄糖醛酸苷酶的酶學(xué)性質(zhì)及催化

2、反應(yīng)動(dòng)力學(xué)；分析和計(jì)算糖基化后酶的構(gòu)象穩(wěn)定性及熱力學(xué)參數(shù),探討糖基化對(duì)β-D-葡萄糖醛酸苷酶催化特性和結(jié)構(gòu)的影響。主要研究結(jié)果如下:
　　 采用硫酸銨分級(jí)沉淀、陰離子交換層析、凝膠層析和親和層析等方法,分別純化了產(chǎn)紫青霉、重組大腸桿菌和重組畢赤巴斯德酵母表達(dá)的β-D-葡萄糖醛酸苷酶(分別稱為PGUS、PGUS-P和PGUS-E),獲得了三種β-D-葡萄糖醛酸苷酶的電泳級(jí)純品,HPLC檢測(cè)純度分別為92.1％、95.3％和98.3

3、％,其純度滿足后續(xù)糖基化與質(zhì)譜分析的要求。
　　 采用MALDI-TOF MS測(cè)定PGUS、PGUS-E和PGUS-P的精確分子量分別為69.72 kDa、67.93 kDa和78.83 kDa。肽質(zhì)量指紋圖譜結(jié)合串聯(lián)質(zhì)譜對(duì)氨基酸序列鑒定表明,三種酶均和β-D-葡萄糖醛酸苷酶基因pgus(EU095019)所編碼的氨基酸序列相對(duì)應(yīng)。糖基化分析結(jié)果表明,PGUS-P為N-糖基化類型翻譯后修飾,其糖含量為14.42％,而PGUS和P

4、GUS-E無(wú)明顯糖基化修飾。酶學(xué)性質(zhì)比較分析表明,三種β-D-葡萄糖醛酸苷酶最適pH、最適反應(yīng)溫度、對(duì)底物對(duì)硝基苯-葡萄糖醛酸苷(PNPG)和甘草酸的催化反應(yīng)動(dòng)力學(xué)參數(shù)及催化水解甘草酸模式均有顯著差異。
　　 以純化后的PGUS-P為研究對(duì)象,用糖苷酶F(PNGase F)對(duì)其進(jìn)行去糖基化,比較了PGUS-P去糖基化前后的酶學(xué)性質(zhì)和反應(yīng)動(dòng)力學(xué),表明PGUS-P去糖基化后,其最適反應(yīng)溫度未明顯變化,但最適pH值范圍增大,對(duì)金屬離子

5、敏感性降低。去N-糖基化后的PGUS-P與底物PNPG和甘草酸的親和力均增強(qiáng)。
　　 比較了去糖基化前后PGUS-P的穩(wěn)定性及構(gòu)象變化,表明去糖基化后的PGUS-P耐變性劑、有機(jī)溶劑及表面活性劑能力均下降,且更容易被胰蛋白酶水解。差示量熱掃描(DSC)研究表明,去糖基化的PGUS-P熱變性溫度Td和ΔH均下降,酶蛋白的熱穩(wěn)定性降低。熒光光譜和圓二色譜分析表明,去糖基化處理未改變PGUS-P酶蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu),但誘導(dǎo)了酶蛋白分子伸展