促甲狀腺激素增加肝臟甘油三酯含量的機制研究.pdf

1、研究背景:
　　非酒精性脂肪肝(NAFLD)是一種無過量飲酒史、肝實質細胞脂肪變性和脂肪貯積為特征的臨床病理綜合征。疾病譜隨病程的進展表現不一，包括單純性脂肪肝、脂肪性肝炎、脂肪性肝纖維化和脂肪性肝硬變4個病理類型。脂肪性肝炎和纖維化可以直接或間接地加速并存的肝臟疾病的進展，從而導致肝硬化或肝癌。NAFLD與代謝綜合征、糖代謝異常、糖尿病密切相關，多項前瞻性研究證實，NAFLD可預測2型糖尿病和心血管疾病的發(fā)病率和死亡率，嚴重危害

2、人們生命健康。近年來，非酒精性脂肪肝的發(fā)病率逐年增加，根據地區(qū)不同，NAFLD在一般人群患病率為9％～36.9％，美國NAFLD患病率為20％。隨著NAFLD病因學研究的深入，除了傳統(tǒng)的NAFLD危險因素如BMI過高、高血脂癥、糖尿病和35～50歲年齡段等因素外，內分泌激素的影響如生長激素缺乏、性腺功能減退、垂體功能減退、多囊卵巢綜合征、高皮質醇血癥、甲狀腺功能減退等，在NAFLD的發(fā)病過程中起了重要的作用。
　　亞臨床甲狀腺功能

3、減退癥(subclini calhypot hyroidism，SCH)，是指血清促甲狀腺激素水平升高而游離甲狀腺素維持在正常參考值范圍內，簡稱亞甲減，是甲狀腺功能減退的早期階段。臨床資料提示TSH與NAFLD患病率存在正相關。NAFLD患者血清TSH水平明顯高于正常對照，亞甲減患者其NAFLD患病率較正常甲功者明顯增加(29.9％vs19.5％);亞甲減是預測NAFLD發(fā)生的獨立危險因素，危險度(95％CI)為2.21(1.42-3.

4、44)。臨床資料顯示亞甲減患者血甘油三酯(TG)水平升高。由于TSH是SCH患者唯一發(fā)生改變的甲狀腺功能指標，我們的研究將從體內、體外水平研究TSH是否能增加肝細胞內脂質蓄積，及其相關的分子機制。
　　肝臟是人體最大的內臟器官，在調節(jié)機體TG代謝方面起中心作用。肝細胞脂肪變是NAFLD的標志之一，組織學觀察標準為5％以上的肝細胞出現脂肪變即可認定為NAFLD。肝臟脂滴主要是由甘油三酯組成。固醇調節(jié)元件結合蛋白(SREBPs)是3個

5、調節(jié)脂代謝的主要核轉錄因子的總稱。其中SREBP-1c直接參與調控有關脂肪酸和甘油三酯合成相關酶基因的表達，是脂肪合成基因的主要轉錄調節(jié)因子。SREBP-1c調節(jié)的靶基因包括低密度脂蛋白(LDL)受體、乙酰輔酶A羧化酶(ACC)、脂肪酸合成酶(FAS)、S14、葡萄糖激酶(GK)和磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶(PEP-CK)等有關脂肪合成和葡萄糖代謝的基因。SREBP-1c在脂肪肝病理過程中的作用已被多種模型證明。在人脂肪肝標本中，SREBP

6、-1c表達量較正常肝臟增加5倍。SREBP-1c的量主要受到三方面的調節(jié):轉錄水平的調節(jié)、SREBP-1c前體蛋白轉化為成熟體蛋白時的蛋白裂解過程的調節(jié)、成熟體SREBP-1c（nSREBP-1c）的翻譯后修飾調節(jié)，其中，SREBP-1c的轉錄水平的調節(jié)被認為是其主要的調節(jié)形式。
　　過氧化物酶體增殖物激活受體(PPARs)是目前研究最廣泛的核受體，近來研究表明，PPARα也參與了脂肪酸的從頭合成。研究表明，PPARα是SREBP

7、-1c活性的重要調控因子。非諾貝特喂養(yǎng)的的小鼠，其肝臟前體和成熟體SREBP-1c表達量明顯增加，FASN、ACC1、SCD1等SREBP-1c的下游分子表達量隨之增加;PPARα敲除的小鼠，其脂肪酸合成下降，肝臟中SREBP-1cmRNA和蛋白表達量較野生型小鼠均明顯降低;PPARα可以直接結合SREBP-1c啟動子區(qū)域，誘導其表達。
　　本研究以肝臟甘油三酯合成的關鍵調控分子SREBP-1c為切入點，圍繞TSH調控其表達的主要

8、信號通路及交匯組成的網絡進行研究:分別通過體內研究（Tshr基因敲除小鼠，非諾貝特喂養(yǎng)小鼠，forskolin腹腔注射小鼠及H89腹腔注射小鼠）與體外細胞水平研究（多種屬的肝原代細胞和肝細胞株），論證cAMP/PKA/PPARα/SREBP-1c信號通路在此調控過程的地位和作用，闡明TSH對肝臟甘油三酯合成過程的影響，揭示亞臨床甲減致NAFLD的分子機制。為探究TSH導致脂肪肝的分子機制提供新的觀點;在醫(yī)學實踐上為NAFLD提供新的治療

9、思路和策略。
　　目的:
　　1.前期研究已證明肝細胞膜上表達功能性TSH受體(TSHR)，本課題擬通過研究TSHR介導的TSH作用，上調肝細胞SREBP-1c表達，增加肝細胞內總甘油三酯含量，促進肝臟脂肪變及NAFLD的發(fā)生，從而揭示TSH在甘油三酯合成中的可能作用，揭示亞臨床甲減致NAFLD的分子機制。
　　2、通過TSH刺激肝細胞cAMP/PKA/PPARα信號途徑的實驗研究，揭示TSH增加肝細胞SREBP-1c

10、的表達的作用機制。
　　3、PKA、PPARα和SREBP-1c等分子在此調控過程中居于核心地位和發(fā)揮關鍵作用。
　　研究方法:
　　1、細胞培養(yǎng):1）肝細胞系人肝癌細胞HepG2均按培養(yǎng)條件要求培養(yǎng)。2）小鼠原代肝細胞采用原位二步灌注法，接種于預鋪鼠尾膠原的6cm培養(yǎng)皿，置37℃5％CO2條件下培養(yǎng)，每24小時換液。待細胞長至70％～80％時，棄去原完全培養(yǎng)液，PBS洗兩遍，以無血清培養(yǎng)液培養(yǎng)過夜后再添加相應處理，以

11、排除血清中脂蛋白及各種激素對實驗的干擾作用。
　　2、動物模型:Tshr基因敲除小鼠（普通喂養(yǎng)及高脂喂養(yǎng)），菲諾貝特喂養(yǎng)C57BL/6J小鼠，PPARα基因敲除小鼠（非諾貝特喂養(yǎng)），forskolin腹腔注射小鼠及H89腹腔注射小鼠。
　　3、油紅染色、H&E染色及電鏡觀察細胞內脂質沉積情況。
　　4、肝細胞內及血清TG測定采用TG檢測試劑盒（北京普利萊公司），實驗操作按照說明書進行定量測定。
　　5、采用RT-

12、PCR檢測PPARα、SREBP-1c及其分別的下游分子、TG合成相關基因mRNA的表達。
　　6、采用WesternBlotting檢測PPARα、SREBP-1c前體及成熟體蛋白水平變化。
　　7、采用免疫熒光及免疫組化方法檢測PPARα、SREBP-1c在肝組織及細胞中的表達及分布。
　　8、化學合成siRNA干擾實驗檢測指標:特異性針對SREBP-1c或PPARα等干擾后，相應分子及其下游分子的代謝關鍵酶及相應

13、調控因子在mRNA及蛋白水平的變化。
　　9、重組質粒轉染實驗檢測指標:轉染DN-SREBP-1c顯性負性失活突變質粒后，信號通路相應分子的變化及相應調控因子在mRNA及蛋白水平的變化。
　　10、熒光素酶活性分析檢測指標:含有PPARα結合位點的SREBP-1c啟動子區(qū)域重組質粒熒光素酶活性分析。
　　11、免疫共沉淀實驗(co-IP)檢測指標:磷酸化PPARα表達。
　　12、血脂及肝功測定檢測指標:血脂（總

14、膽固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白膽固醇、高密度脂蛋白膽固醇）;肝功（谷丙轉氨酶、谷草轉氨酶、總膽紅素）。采用OlympusAu5400全自動生化分析儀（山東省立醫(yī)院檢驗科）檢測。
　　13、血清TT4，TT3，TSH水平的測定收集待測血清，采用放免法按照試劑盒要求進行操作。
　　14、采用SAS系統(tǒng)和SPSS17.0統(tǒng)計軟件分析實驗數據。主要有如計量資料采用(x)±s做描述，多組均數比較采用方差分析，方差不齊的采用Kruska

15、l-Wallis秩和檢驗。
　　結果:
　　1、TSH增加肝臟甘油三酯聚積，促進肝臟脂肪變
　　TSH能劑量和時間依賴性地增加HepG2細胞內脂滴含量;TSH處理細胞48h，能劑量依賴性地增加細胞內甘油三酯含量。高脂喂養(yǎng)20周后，野生型小鼠肝臟呈油膩灰黃狀，而Tshr-/-小鼠肝臟形態(tài)相對正常;油紅染色顯示，野生型小鼠肝臟脂滴含量較Tshr-/-小鼠明顯增加;Tshr-/-小鼠肝臟甘油三酯含量明顯減少(P＜0.05)。

16、即使普通飲食喂養(yǎng)的小鼠，Tshr-/-小鼠肝臟脂滴含量和甘油三酯含量也明顯減少(P＜0.05)。
　　2、甘油三酯代謝相關基因表達改變
　　我們在Tshr-/-小鼠肝臟中檢測了參與TG從頭合成(FASN、ACC1、SCD1、DGAT2、GPAT1)、脂肪酸β氧化(CPT1α)、脂肪酸攝取(FABP)、VLDL輸出(ApoB、MTPF)等相關基因的表達。TSHR敲除對TG代謝的各個環(huán)節(jié)均發(fā)生了影響，其中以TG從頭合成(DNL)

17、相關基因表達下降最為顯著，且DNL調節(jié)最重要的分子SREBP-1cmRNA表達量明顯下降(P＜0.05)。
　　3、SREBP-1c在TSH調節(jié)TG合成中的中心作用
　　Tshr-/-小鼠肝臟中SREBP-1c前體及成熟體蛋白表達量均較野生型小鼠明顯降低。在肝細胞系中，SREBP-1c及其下游直接調控分子表達量呈TSH劑量依賴性增加(P＜0.05)。用SREBP1-siRNA或DN-SREBP-1c抑制SREBP-1c表達后

18、，TSH的上述作用消失。
　　4、PPARα激活促進SREBP-1c表達，增加肝臟甘油三酯含量
　　非諾貝特喂養(yǎng)的小鼠肝臟甘油三酯和SREBP-1表達均較對照組小鼠增加，呈非諾貝特劑量依賴性（P＜0.05）。在肝細胞系中，非諾貝特能劑量依賴性增加細胞內甘油三酯含量和SREBP-1c表達。在細胞中用siRNA下調PPARα表達后，SREBP-1c表達相應減少。非諾貝特處理能劑量依賴性激活SREBP-1c啟動子轉錄功能，使熒光素

19、酶活性明顯增加。
　　5、PPARα介導TSH對SREBP-1c的調節(jié)，且PKA可使PPARα磷酸化激活
　　Tshr-/-小鼠肝臟中PPARαmRNA、蛋白表達量均較野生型小鼠明顯降低(P＜0.05)。在肝細胞系中，PPARα及其下游直接調控分子表達量呈TSH劑量依賴性增加(P＜0.05)。腺苷酸環(huán)化酶(Adenylylcyclase，AC)的特異性激活劑Forskolin注射小鼠，肝臟SREBP-1c、PPARα表達量均

20、較野生組增加;而PKA的特異性抑制劑H89注射小鼠可減少肝臟SREBP-1c、PPARα表達。用PPARα特異性抑制劑MK886抑制PPARα活性后，TSH引起的SREBP-1c表達增加及SREBP-1c啟動子區(qū)域熒光活性增加均被抑制。co-IP證實PKA可通過增加PPARα磷酸化從而增加其活性。
　　結論:
　　1、TSH增加肝臟甘油三酯聚積，促進肝臟脂肪變;
　　2、TSH對甘油三酯代謝的各個環(huán)節(jié)均發(fā)生了影響，其中