促甲狀腺激素通過甘油磷酸酰基轉(zhuǎn)移酶3調(diào)節(jié)甘油三酯合成.pdf

1、目的:
　　1、確定促甲狀腺激素調(diào)節(jié)脂肪組織甘油三酯含量，利用亞臨床甲狀腺功能減退的小鼠模型及TSH刺激的成熟3T3-L1脂肪細胞研究TSH對脂肪細胞甘油三酯合成的作用。
　　2、通過TSH受體敲除的小鼠體內(nèi)脂質(zhì)代謝相關(guān)酶的mRNA變化，篩選出TSH可能的作用靶點。
　　3、通過TSH刺激成熟3T3-L1脂肪細胞，檢測GPAT3、PPARγ、p-AMPK、t-AMPK的蛋白、mRNA水平，探討TSH引起脂質(zhì)合成增加的可

2、能機制。
　　4、通過TSH受體敲除的小鼠模型，檢測GPAT3、PPARγ、p-AMPK、t-AMPK的蛋白、mRNA水平，進一步探討TSH引起脂質(zhì)合成增加的可能機制。
　　5、利用PPARγ、AMPK特異性阻斷劑或TSHR、PPARγ、GPAT3特異性小干擾RNA（SmallⅠnterfering RNA，siRNA）或轉(zhuǎn)染持續(xù)激活或抑制性AMPK質(zhì)粒處理細胞，檢測GPAT3、PPARγ、p-AMPK、t-AMPK的表達，

3、探討TSHR、AMPK、PPARγ、GPAT3在TSH所引起的脂質(zhì)沉積中所起的作用。
　　方法:
　　1、細胞培養(yǎng):1）3T3-L1細胞根據(jù)美國模式菌種收集中心(ATCC)細胞培養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)使用高糖DMEM培養(yǎng)液中培養(yǎng)、誘導(dǎo)分化。2）人脂肪原代細胞、小鼠脂肪原代細胞人或小鼠脂肪組織剪碎，使用Ⅰ型膠原酶在37℃孵箱中消化30-40 min，過篩去掉未消化的組織，PBS沖洗細胞，并接種在新的培養(yǎng)皿中，使用含新生牛血清的DMEM/F12

4、培養(yǎng)基培養(yǎng)。
　　2、動物模型:通過小劑量他巴唑喂養(yǎng)建立亞臨床甲狀腺功能減退小鼠模型，并在Jackson實驗室購買TSHR敲除小鼠模型。
　　3、采用RT-PCR檢測GPAT3、PPARγ mRNA的表達。
　　4、采用Western Blotting檢測GPAT3、PPARγ、p-AMPK、t-AMPK及beta-actin蛋白水平變化。
　　5、采用免疫熒光方法檢測GPAT3、PPARγ在脂肪組織及細胞中的表

5、達，H&E染色了解組織結(jié)構(gòu)。
　　6、GPAT3、PPARγ及TSHR基因沉默:以GPAT3、PPARγ及TSHR特異性siRNA轉(zhuǎn)染成熟3T3-L1脂肪細胞以沉默GPAT3、PPARγ及TSHR表達。
　　7、AMPK持續(xù)激活或抑制:以CA-AMPK或DN-AMPK質(zhì)粒轉(zhuǎn)染成熟3T3-L1脂肪細胞以持續(xù)激活或抑制AMPK表達。
　　8、GPAT3、PPARγ活性檢測:采用熒光素酶報告基因的方法檢測GPAT3、PPAR

6、γ的活性。
　　9、采用酶聯(lián)免疫分析檢測小鼠體內(nèi)adiponectin的水平變化。
　　結(jié)果:
　　1、促甲狀腺激素調(diào)節(jié)脂肪組織甘油三酯含量:亞臨床甲狀腺功能減退的小鼠表現(xiàn)為體重增加，總脂肪重量增加，有較高的BMI水平及附睪脂肪指數(shù)。進一步處死小鼠后分別觀察了兩組小鼠的附睪、腎周白色脂肪組織的外觀及脂肪細胞的體積大小（H&E染色），發(fā)現(xiàn)亞臨床甲狀腺功能減退的小鼠附睪、腎周白色脂肪組織含量較對照組小鼠顯著增加，脂肪細胞體

7、積增大。通過體外實驗證實，促甲狀腺激素刺激顯著增加成熟的3T3-L1脂肪細胞內(nèi)的脂滴數(shù)量。與之一致的，3T3-L1脂肪細胞內(nèi)的甘油三酯含量在TSH的刺激下呈時間、劑量依賴性的增加。
　　2、TSH調(diào)節(jié)甘油三酯合成是通過GPAT3:體內(nèi)實驗發(fā)現(xiàn)，TSHR敲除的小鼠體內(nèi)GPAT3 mRNA及蛋白表達均顯著下降。體外研究發(fā)現(xiàn)TSH能刺激GPAT3的蛋白表達及其在胞漿的聚集并增加GPAT3的活性。利用GPAT3 siRNA干擾掉GPAT3

8、后，TSH介導(dǎo)的甘油三酯合成被阻斷。
　　3、PPARγ在促甲狀腺激素介導(dǎo)的脂質(zhì)生成中是必不可少的:體內(nèi)研究發(fā)現(xiàn)，TSHR敲除的小鼠PPARγ mRNA水平較對照組小鼠水平下降。Western blotting檢測發(fā)現(xiàn)TSHR敲除的小鼠PPARγ蛋白較對照組小鼠表達水平下降。體外研究顯示，在成熟的3T3-L1脂肪細胞中，利用免疫熒光的方法檢測PPARγ的蛋白表達，發(fā)現(xiàn)TSH刺激的細胞PPARγ蛋白在細胞核內(nèi)的聚集明顯。Wester

9、n blotting檢測發(fā)現(xiàn)，TSH刺激的成熟的3T3-L1脂肪細胞、人原代脂肪細胞及小鼠原代脂肪細胞中PPARγ核蛋白表達顯著增加。實時定量PCR顯示促甲狀腺激素刺激的成熟的3T3-L1脂肪細胞PPARγmRNA表達顯著增加。利用PPARγ siRNA干擾掉PPARγ后，TSH介導(dǎo)的甘油三酯合成及激活GPAT3的作用被阻斷。
　　4、AMPK介導(dǎo)TSH引起的PPARγ/GPAT3上調(diào)及脂質(zhì)合成:體內(nèi)實驗證實，AICAR喂養(yǎng)的TS

10、HR受體敲除的小鼠脂肪組織PPARγ、GPAT3的蛋白、mRNA表達均下降。體外研究顯示，轉(zhuǎn)染CA-AMPK抑制TSH引起的PPARγ/GPAT3上調(diào)及脂質(zhì)合成;轉(zhuǎn)染DN-AMPK激活TSH引起的PPARγ/GPAT3上調(diào)及脂質(zhì)合成。
　　5、TSHR參與TSH介導(dǎo)的脂質(zhì)生成:體內(nèi)實驗證實，TSHR敲除的小鼠表現(xiàn)為體重下降，附睪脂肪重量降低，有較低的附睪脂肪指數(shù)。進一步處死小鼠后分別觀察了兩組小鼠的附睪、腎周白色脂肪組織的外觀及脂

11、肪細胞的體積大小(H&E染色)，發(fā)現(xiàn)TSHR敲除的小鼠附睪、腎周白色脂肪組織含量較野生型小鼠顯著降低，脂肪細胞體積下降。Western顯示TSHR敲除的小鼠GPAT3表達下降。通過體外實驗證實，利用TSHR siRNA干擾掉TSHR后，TSH介導(dǎo)的甘油三酯合成及激活A(yù)MPK/PPARγ/GPAT3的作用被阻斷。
　　結(jié)論:
　　在成熟脂肪細胞中，TSH通過結(jié)合到TSH受體，阻斷AMPK Thr172位點的磷酸化，激活PPAR