GSK-3β活性對宮頸癌演進、凋亡及對放、化療敏感性影響的實驗性研究.pdf

1、研究背景
　　宮頸癌是嚴重威脅婦女健康的常見婦科腫瘤，在發(fā)展中國家居婦科惡性腫瘤的首位。雖然我國對宮頸癌的防治已取得很大成效，近年來隨著人乳頭狀瘤病毒(HPV)感染率的上升和社會生活的變化，宮頸癌的發(fā)病率呈增高趨勢，近20年來發(fā)病明顯趨于年輕化，且宮頸腺癌比例增加。因為腺癌易早期發(fā)生淋巴結轉移，對放療的敏感性較差，對化療容易產生耐藥，因此治療難度加大，預后不理想。因而尋找一種科學、可行的途徑來增強放、化療療效，改善預后成為宮頸癌治

2、療領域研究的熱點問題。
　　糖原合成激酶-3（glycogensynthesiskinase-3，GSK-3）是一多功能絲氨酸/蘇氨酸類激酶，廣泛地分布在迄今研究過的所有真核生物中，在哺乳動物中包括兩個亞型，即GSK-3α和GSK-3β。GSK-3β是糖原代謝過程中的重要限速酶，除了可以在胰島素調控下磷酸化肝糖原合成酶（glycogensynthesis）并使之失活外，GSK-3β還在多個重要信號通路中扮演了關鍵角色，例如Wnt/

3、β-cateninpathway，PI3K/AKTpathway，Hedgehogpathway，在蛋白合成、細胞增殖、細胞分化、細胞運動、細胞凋亡以及腫瘤發(fā)生等方面都扮演了重要角色。
　　研究發(fā)現，GSK-3β與乳腺癌、結腸癌、卵巢癌等多種腫瘤的發(fā)生密切相關，且在研究宮頸癌發(fā)病機理相關的多條信號轉導通路中，我們發(fā)現GSK-3β是這些通路共同的交叉點，說明GSK-3β在宮頸癌的發(fā)生發(fā)展過程中起著重要的作用；但由于GSK-3β均不是

4、研究的主要目的蛋白，而僅是被提及，且有關GSK-3β在宮頸癌發(fā)生過程中的作用機制的研究尚未見報道。因此，結合在其他惡性腫瘤中的研究，GSK-3β在新的抗腫瘤治療中將成為一個頗具魅力的靶點。關于GSK-3β在宮頸癌中功能及作用機制的研究，將為探討宮頸腫瘤發(fā)生、發(fā)展、轉移、耐藥機制提供一種新的思路與方法。
　　研究目的
　　觀察GSK-3β表達及活性改變對宮頸癌演進、凋亡和對放、化療敏感性的影響，并通過尋找其可能作用途徑，探討外

5、源性改變GSK-3β活性或表達對宮頸癌放、化療增敏的可能性，為以GSK-3β為靶基因治療宮頸癌提供理論依據。
　　研究方法
　　1)采用免疫組織化學方法，檢測GSK-3β在正常宮頸組織、宮頸癌前病變組織、宮頸惡性組織中的表達情況，分析其表達與臨床分期、病理分級、組織學分型和轉移的相關性；
　　2)利用免疫細胞化學方法、RT-PCR、Westernblot法檢測Hela、Siha細胞中GSK-3β蛋白及其磷酸化蛋白的表達

6、、定位情況；
　　3)LiCl抑制GSK-3β活性后，MTT法檢測Hela、Siha細胞耐藥性的改變；
　　4)Hoechst33342/PI染色檢測LiCl抑制GSK-3β活性對順鉑誘導Hela、Siha細胞凋亡的影響；
　　5)脂質體法將3種表達不同GSK-3β活性的質粒：pcDNA3/GSK-3β-S9A、pcDNA3/GSK-3β-WT、pcDNA3/GSK-3β-K85R轉染宮頸癌Hela細胞株，Wester

7、nblot檢測轉染效率、各轉染細胞內GSK-3β的表達情況；
　　6)免疫熒光法再次驗證瞬時轉染后各組細胞GSK-3β蛋白的表達、細胞內分布，結合倒置顯微鏡觀察細胞表型的改變；
　　7)流式細胞術對比分析各轉染組細胞周期變化，透射電鏡觀察細胞超微結構變化；
　　8)經過G418抗性篩選，獲得穩(wěn)定轉染的Hela-S9A、Hela-WT、Hela-K85R、Hela-Vec細胞株，MTT比色法繪制細胞生長曲線，觀察GSK-

8、3β蛋白對細胞增殖能力的影響；
　　9)平板克隆形成實驗、MTT法繪制細胞生長曲線，觀察GSK-3β-S9A蛋白高表達對Hela細胞放療敏感性的影響；MTT法檢測6GyX線照射后24、36、48、72和96h對Hela細胞生長的影響；
　　10)Westernblot檢測不同劑量X線照射后，Hela細胞中GSK-3β及其下游β-catenin蛋白的誘導表達；
　　11)通過MTT實驗進行體外藥物敏感性分析，計算Hela

9、-S9A、Hela-WT、Hela-K85R、Hela-Vec及Hela細胞對順鉑的IC50值，分析GSK-3β-S9A蛋白高表達對Hela細胞順鉑敏感性的影響；MTT比色法檢測5μg/ml順鉑作用后12、24、36、48和72h對Hela細胞生長的影響；
　　12)Westernblot檢測5μg/ml順鉑作用48h后，Hela細胞中GSK-3β及其下游β-catenin蛋白的誘導表達；
　　13)Westernblot檢

10、測各組細胞內凋亡相關因子Bax和Bcl-2的表達及活性。
　　研究結果
　　1)GSK-3β蛋白是普遍存在的，隨著從癌前病變發(fā)展至癌，GSK-3β蛋白表達量基本呈遞減趨勢，腺癌中的表達量明顯降低（p<0.05）；pGSK-3βSer9蛋白在病變組織的表達量均高于正常組織；
　　2)Hela細胞中，GSK-3β主要定位于胞漿，胞核中幾乎沒有；而Siha細胞中，GSK-3β胞漿、胞核中均有表達；
　　3)LiCl預處

11、理Hela、Siha細胞6h，可明顯增加其順鉑耐藥性，且Hela細胞對順鉑耐藥性更強；
　　4)Hoechst33342/PI染色證明LiCl預處理Hela、Siha細胞6h可明顯降低順鉑誘導的細胞凋亡的發(fā)生；
　　5)細胞總蛋白提取物中，Hela、Siha細胞中總GSK-3β蛋白表達無明顯差異，而Hela細胞，處于活性抑制狀態(tài)的pGSK-3βSer9表達量明顯低于Siha細胞，說明在Hela細胞中有更多有活性狀態(tài)的GSK-

12、3β；
　　6)成功建立四組表達不同活性狀態(tài)的pcDNA3.0/GSK-3β質粒穩(wěn)定轉染的細胞株Hela-S9A、Hela-WT、Hela-K85R及陰性對照Hela-Vec細胞株，Westernblot檢測表明：各組細胞在GSK-3β蛋白分子量46KDa處均有明顯蛋白表達條帶，GSK-3β轉染組細胞株中總GSK-3β蛋白水平均有明顯升高；但各組的pGSK-3βSer9蛋白水平比陰性對照組有明顯降低；
　　7)GSK-3β-

13、S9A轉染可明顯抑制Hela細胞的生長，并將細胞周期阻滯于G2-M期，從而阻礙DNA合成；透射電鏡下觀察也證實，細胞超微結構呈典型凋亡的形態(tài)學改變；
　　8)免疫熒光法檢測不同活性狀態(tài)的GSK-3β質粒轉染后GSK-3β蛋白定位情況。GSK-3β在正常的Hela細胞主要在胞漿表達，胞核中幾乎沒有；Hela-WT的細胞中，GSK-3β蛋白還是以胞漿表達為主，Hela-K85R細胞中，除了個別由于轉染毒性凋亡的細胞，胞漿和胞核均有表達

14、，以胞核表達較多，而導入GSK-3β-S9A突變體細胞中，GSK-3β幾乎以胞核表達為主；
　　9)不同劑量X線照射后，Hela-S9A細胞克隆形成率及細胞活力隨著X線照射劑量的升高而下降，有較好的劑量-效應關系，細胞活力及存活率均明顯低于未轉染Hela細胞（p<0.01）；6GyX線照射后Hela-S9A細胞生長抑制率隨時間延長顯著增加，呈現良好的時間依賴關系，各時間點細胞生長抑制率明顯高于未轉染Hela細胞；
　　10)

15、Westernblot檢測結果提示：Hela-S9A細胞中GSK-3β蛋白表達水平隨著X線照射劑量的升高而明顯升高，有較好的劑量-效應關系；且同一劑量下，均比未轉染Hela細胞明顯增加；而β-catenin蛋白表達明顯下降；
　　11)各轉染組細胞存活率均隨順鉑藥物濃度升高而下降；在同一藥物濃度下，Hela-S9A細胞存活率明顯下降，48h的IC50值為（0.38±0.02）μg/ml；5μg/ml順鉑作用后各組細胞生長抑制率隨著

16、時間的延長而顯著增加，呈現良好的時間依賴關系；各檢測點Hela-S9A細胞生長抑制率明顯高于未轉染Hela細胞；
　　12)Westernblot檢測結果提示：Hela-S9A細胞GSK-3β蛋白表達水平隨著順鉑作用時間的延長而明顯升高，呈現良好的時間依賴關系；且同一劑量下，均比未轉染Hela細胞明顯增加；而β-catenin蛋白表達明顯下降；
　　13)在Wnt/β-catenin信號轉導通路中，構成性激活GSK-3β即G

17、SK-3β-S9A的高表達可誘導促凋亡基因Bax的高表達及抑凋亡基因Bcl-2的低表達，進而有助于抑制前體癌蛋白β-catenin表達。
　　結論：在本實驗條件下：
　　1)GSK-3β在宮頸癌中呈低表達，且GSK-3β的表達隨宮頸癌分期的升高而降低；
　　2)胞核內pGSK-3βSer9表達減弱，是Hela細胞區(qū)別于Siha細胞的生物學特征之一；
　　3)GSK-3β功能發(fā)揮與其細胞定位密切相關，LiCl通過引

18、起細胞核內pGSK-3βSer9表達增強可提高Hela、Siha細胞對順鉑的耐藥性；
　　4)構成性激活GSK-3β可明顯抑制細胞增殖，并增強X線放療、順鉑化療誘導的細胞凋亡，增強放、化療對細胞的生長抑制，并具有較好的劑量-效應及時相性關系；
　　5)在Wnt/β-catenin信號轉導通路中，構成性激活GSK-3β的可通過誘導凋亡相關基因Bax和Bcl-2所介導的凋亡途徑來抑制細胞生長及侵襲，GSK-3β起著關鍵的負性調控