沉默GOLPH3對肝細胞癌化療敏感性影響的體內(nèi)外實驗研究.pdf

1、目的:肝細胞癌(Hepatocellular carcinoma，HCC)是我國發(fā)生率與死亡率最高的惡性腫瘤之一;部分HCC患者在就診時往往已屬晚期，失去手術(shù)治療機會，且容易發(fā)生侵襲與轉(zhuǎn)移，預后較差。肝細胞癌對化療藥物不敏感一直是治療肝細胞癌的難點。高爾基體磷蛋白3(Golgi phosphoprotein3，GOLPH3)主要定位在高爾基體外側(cè)網(wǎng)絡(TGN)，在細胞生理中起著重要的作用，主要在高爾基形態(tài)維持、囊泡運輸、蛋白糖基化、受體

2、分配、線粒體功能等五個方面發(fā)揮作用。GOLPH3作為一種新的癌基因，由Kenneth L.Scott基于對人類癌癥的全基因組拷貝數(shù)的分析，發(fā)現(xiàn)5p13位點在多種類型的實體腫瘤，如肺癌，卵巢癌，乳腺癌，前列腺癌和黑色素瘤中，呈現(xiàn)明顯的擴增趨勢。有研究報道腫瘤組織中GOLPH3高表達可以提高以5-Fu為基礎輔助化療的結(jié)直腸癌患者的預后效果，增加結(jié)直腸癌細胞中GOLPH3的表達也可以提高腫瘤細胞對5-Fu化療藥物的敏感性。但值得注意的是，有報

3、道沉默口腔鱗狀細胞癌細胞GOLPH3表達可通過調(diào)節(jié)Caspase-3，Bcl-2和cytochrome-c的表達來提高化療效果
　　方法:應用RT-PCR和Western blot技術(shù)檢測8株肝細胞癌細胞系(Huh7、BEL-7402、HCCLM3、HepG2、SMMC-7721、SKHEP1、MHCC97H、MHCC97L)和一株正常肝細胞細胞系（HL-7702）中GOLPH3在mRNA及蛋白水平的表達情況。選擇GOLPH3相對

4、高表達細胞系，使用siRNA構(gòu)建干擾的GOLPH3肝細胞癌細胞系，通過AnnexinⅤ-PI染色法，流式細胞儀檢測5-FU，ADM， Cyclophosphamide，OXA對肝細胞癌細胞化療藥物敏感性的影響。使用慢病毒感染的方式構(gòu)建穩(wěn)定的GOLPH3干擾的huh7細胞系，通過裸鼠體內(nèi)體內(nèi)成瘤實驗，檢測GOLPH3在體內(nèi)環(huán)境下對腫瘤生長及化療藥物敏感性的影響。篩查與細胞凋亡相關的基因，探究GOLPH3影響肝細胞癌化療敏感性可能的分子機制

5、。
　　結(jié)果:通過RT-PCR和Western blot技術(shù)檢測8株肝細胞癌細胞系(Huh7、BEL-7402、HCCLM3、HepG2、SMMC-7721、SKHEP1、MHCC97H、MHCC97L)中GOLPH3的mRNA及蛋白表達水平結(jié)果明顯高于正常肝細胞細胞系(HL-7702)，其中huh7和SMMC-7721呈現(xiàn)相對高表達。使用siRNA沉默huh7和SMMC-7721的GOLPH3表達，流式細胞儀結(jié)果顯示GOLPH3

6、干擾組應用5-FU，ADM，Cyclophosphamide，OXA后，其凋亡比例明顯高于對照組(P＜0.05)，兩組細胞凋亡能力差異具有統(tǒng)計學意義。使用慢病毒感染的方式構(gòu)建穩(wěn)定的GOLPH3干擾的huh7細胞系后，通過裸鼠體內(nèi)成瘤發(fā)現(xiàn)，干擾GOLPH3組，肝細胞癌體內(nèi)成瘤速度明顯低于正常對照組，且使用化療藥物阿霉素后，干擾GOLPH3組的腫瘤抑制作用明顯強于對照組。
　　結(jié)論:干擾GOLPH3可增加5-FU、OXA、ADM、Cy