光動力制備的皮膚鱗癌細胞裂解物對鼠樹突狀細胞表型及功能成熟的影響.pdf

1、背景：機體免疫系統(tǒng)對腫瘤細胞的生長有識別、監(jiān)視和預防的功能,免疫系統(tǒng)啟動對腫瘤細胞進行殺傷的重要環(huán)節(jié)之一是對腫瘤特異性抗原的識別和攝取,這個復雜的生理過程中樹突狀細胞(Dendritic cell,DC)起到了重要的作用。DC是目前所知的功能最強的抗原提呈細胞(antigen-presenting cell,APC),因其成熟時伸出許多樹突樣或偽足樣突起而得名。正常生理情況下樹突狀細胞處于未成熟狀態(tài),低表達MHCⅠ/Ⅱ類分子、黏附分子和

2、共刺激分子,但具有強大的抗原識別吞噬能力。在受到炎癥因子等刺激后樹突狀細胞分化成熟,抗原遞呈能力增強,將加工處理過的抗原肽-復合物呈遞給T淋巴細胞,啟動宿主的抗腫瘤免疫應(yīng)答。近幾年來,利用細胞因子在體外誘導培養(yǎng)大量樹突狀細胞技術(shù)的成熟,使得樹突狀細胞在腫瘤免疫療法領(lǐng)域逐漸得到發(fā)展應(yīng)用。5-氨基酮戊酸光動力療法(5-amininolevilinic acid-photodynamic therapy,ALA-PDT)是一種新型無創(chuàng)傷性治療

3、腫瘤等疾病的新技術(shù),特別是對皮膚腫瘤疾病不僅可在組織學上實現(xiàn)逆轉(zhuǎn),而且能在不增加細胞毒性的情況下預防皮膚癌前期病變發(fā)生及降低皮膚癌發(fā)生概率。光動力療法作用機制不僅包括直接對腫瘤細胞殺傷、損傷腫瘤組織脈管系統(tǒng),而且能誘導機體抗腫瘤免疫應(yīng)答。研究發(fā)現(xiàn),腫瘤局部光動力治療可以誘導局部或系統(tǒng)性抗腫瘤免疫反應(yīng),甚至遠處轉(zhuǎn)移病灶亦可受抑制。研究發(fā)現(xiàn)光動力治療后腫瘤組織中有炎癥細胞浸潤和TNF-α,IL-1β,IL-6等炎癥介質(zhì)表達上調(diào),且局部DC、

4、CD4+T細胞、CD8+T細胞明顯增多。不僅如此,文獻報道光動力體外處理腫瘤細胞的得到的腫瘤細胞裂解物可作為一種新型的瘤苗對腫瘤起到治療和預防作用,具體機制可能與細胞死亡過程中釋放的腫瘤特異性抗原通過誘導DC分化成熟,啟動機體抗腫瘤免疫反應(yīng)有關(guān),因此光動力誘導特異性抗腫瘤的效應(yīng)逐漸受到了更多的關(guān)注。光動力療法是一種光化學療法,其誘導細胞死亡的方式與其他療法(如放療、化療)有顯著不同,且不同照光劑量光動力處理引起細胞的死亡方式(凋亡/壞死

5、)也會有所不同。這種差異是否會影響腫瘤抗原釋放的途徑和程度,使DC不同程度分化成熟,影響DC對抗原的加工和遞呈,最終造成強弱不等的免疫應(yīng)答效應(yīng)?目前國內(nèi)外尚未發(fā)現(xiàn)這方面的研究報道,據(jù)此本實驗重點探討于體外光動力處理皮膚鱗癌細胞制備的細胞裂解物是否能對小鼠骨髓來源的樹突狀細胞表型及功能成熟的起到免疫調(diào)節(jié)作用,且這種調(diào)節(jié)作用強度是否與照光劑量存在量-效關(guān)系。為進一步提高光動力療法免疫應(yīng)答效應(yīng)提供新的理論基礎(chǔ)。
　　目的：通過觀察小鼠骨

6、髓來源的樹突狀細胞表型及功能變化,對光動力制備的皮膚鱗癌細胞裂解物影響DC免疫學效應(yīng)進行研究。包括(1)不同照光劑量光動力處理的腫瘤細胞制備腫瘤細胞裂解物;(2)樹突狀細胞體外誘導、分離培養(yǎng)及鑒定;(3)觀察細胞裂解物對樹突狀細胞免疫學指標變化影響。
　　方法：(1)選擇誘導細胞凋亡、壞死狀態(tài)下不同照光劑量光動力處理腫瘤細胞:選擇小鼠皮膚鱗癌細胞株P(guān)ECA,將PECA細胞與不同的濃度(0.1 mM,0.5 mM,1 mM,5 mM

7、,10 mM)ALA無血清培養(yǎng)基避光條件下共孵育,于孵育1 h,2 h,3 h,4 h,5h,6 h,8 h,10h,12 h,14 h,16 h,18 h,20 h,22 h,24 h后,測定生成的PpⅨ熒光強度。以PpⅨ熒光強度最強的點為最佳ALA濃度及孵育時間。在此基礎(chǔ)上,以不同的照光劑量(0 J/cm2、5 J/cm2、1 J/cm2、2 J/cm2)ALA-PDT處理皮膚鱗癌細胞株P(guān)ECA,采用Hoechst/PI染色及流式細

8、胞術(shù)檢測腫瘤細胞的死亡方式。(2)樹突狀細胞體外誘導培養(yǎng)及鑒定:于細胞因子IL-4、GM-CSF聯(lián)合使用于體外分離誘導小鼠骨髓樹突狀細胞(Dendritic cell,DC),在倒置顯微鏡下每天觀察細胞的生長情況,描述細胞的形態(tài)變化;在培養(yǎng)7天后分別采用透射電子顯微鏡（Transmission Electron Microscope,TEM)、掃描電子顯微鏡（scanning electron microscope,SEM)觀察細胞的形

9、態(tài);并利用抗小鼠 CD11c-PE抗體標記DC,流式細胞術(shù)鑒定DC純度。(3)分析光動力制備的細胞裂解物對DC免疫學指標變化的影響:將制備的光動力細胞裂解物與樹突狀細胞共孵育24小時后,將DC細胞與細胞培養(yǎng)上清取出。分別采用ELISA法檢測上清中DC分泌的IL-12、INF-γ、IL-10等細胞因子變化;采用流式細胞術(shù)檢測DC表面標志分子MHC-Ⅱ、CD80、CD86等表達變化。最后采用混合淋巴細胞反應(yīng)(mixed lymphocyte

10、 reaction,MLR)觀察DC體外對T淋巴細胞增殖作用的影響。
　　結(jié)果：(1)誘導細胞凋亡、壞死狀態(tài)下不同照光劑量的確定:將 PECA細胞與不同的濃度(0.1 mM,0.5 mM,1 mM,5 mM,10 mM)ALA無血清培養(yǎng)基避光條件下共孵育,于孵育1 h,2 h,3 h,4 h,5h,6 h,8 h,10h,12 h,14 h,16 h,18 h,20 h,22 h,24 h后,測定生成的PpⅨ熒光強度,選取0.5

11、mM ALA及5小時孵育時間為最佳組合。采用0 J/cm2、0.5 J/cm2、1 J/cm2、2 J/cm2不同劑量進行照射后,流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡率分別為1.5％、28.0%、11.9%、1.8%;壞死率分別為0.2%、1.0%、11.9%、34.8%。Hoechst/PI染色1.2%、30%、12%、2%。根據(jù)實驗結(jié)果確定0.5 J/cm2照光劑量為誘導細胞凋亡狀態(tài)的最佳劑量,2 J/cm2照光劑量為誘導細胞壞死狀態(tài)的最佳劑量。

12、(2)小鼠骨髓來源的樹突狀細胞分離誘導及鑒定結(jié)果:經(jīng)細胞因子聯(lián)合應(yīng)用體外分離誘導,原代培養(yǎng)小鼠骨髓樹突狀細胞,經(jīng)流式細胞術(shù)鑒定特殊表面標記CD11c-PE,純度為80%左右。利用倒置相差顯微鏡、透射電鏡、掃描電鏡觀察細胞形態(tài)變化并記錄。(3)樹突狀細胞免疫學指標變化;不同光動力劑量處理的腫瘤細胞與DC共培養(yǎng)24小時后,ELISA檢測不同劑量、不同時間點細胞裂解物與 DC共培養(yǎng)上清中的細胞因子INF-γ、IL-12、IL-10分泌量的變化

13、。結(jié)果顯示光動力處理細胞裂解物對DC致敏后,各組細胞因子釋放量高于未致敏 DC組;0.5 J/cm2光動力劑量下分泌的細胞因子的量普遍最高,而2 J/cm2光動力劑量下分泌的細胞因子的量普遍最低;各個劑量下處理6小時細胞因子分泌量均為最高峰,其中在0.5 J/cm2光動力劑量下處理6小時后的細胞裂解物刺激DC釋放到上清的各個細胞因子的分泌量為最高。在此基礎(chǔ)上,我們重點研究0.5 J/cm2光動力劑量處理的細胞裂解物致敏DC后,流式細胞術(shù)

14、鑒定DC表面標記性分子的表達變化,其中細胞裂解物致敏DC組CD80、CD86、MHC-Ⅱ表達量均增加,增加的表達量小于LPS刺激DC組?；旌狭馨图毎磻?yīng)研究光動力處理細胞裂解物致敏樹突狀細胞體外對同種異型 T淋巴細胞的增殖作用,分別以0.5 J/cm2光動力劑量下處理3h,6h,9h,12h,24h細胞裂解物致敏的DC,再與同種異型T淋巴細胞共培養(yǎng),觀察DC對T細胞的刺激指數(shù),其中6h組刺激增殖能力明顯高于3h、9h,12h,24h組,