三氧化二銻對人卵巢癌細胞株SKOV3增殖抑制的研究.pdf

1、目的： 卵巢癌是婦科最常見的惡性腫瘤之一，嚴重威脅婦女的健康。由于缺乏有效的早期診斷的方法，70％的卵巢癌患者被發(fā)現(xiàn)時已是晚期，卵巢癌也是死亡率最高的婦科惡性腫瘤。其主要的死亡原因在于復(fù)發(fā)和包括順鉑在內(nèi)的化療藥耐藥，在現(xiàn)有的治療手段下五年存活率未見明顯增高，且長期化療導致病人耐藥或毒副作用的發(fā)生。因此，尋找新的更有效的藥物以進一步提高卵巢癌患者的生存時間和生活質(zhì)量是非常必要的。銻劑應(yīng)用于人類，歷史悠久，主要用于治療寄生蟲病。上世

2、紀60年代初期進行篩選合成抗癌化合物時發(fā)現(xiàn)數(shù)種銻類化合物有抗癌活性。但一直未進行深入的研究。近年來關(guān)于銻類化合物的抗癌活性重新引起人們的重視。有關(guān)學者研究發(fā)現(xiàn)微摩爾濃度的銻劑(三氧化二銻)能顯著抑制白血病細胞、惡性淋巴細胞生長，而對正常的淋巴細胞無影響，其機理為誘導細胞凋亡。于文強等通過研究不同銻劑對早幼粒細胞白血病凋亡誘導作用比較發(fā)現(xiàn)三價銻劑能夠有效地誘導早幼粒白血病細胞凋亡，提示Sb<,2>O<,3>等三價銻劑在未來的抗癌作用方面有

3、廣闊的應(yīng)用前景。本試驗用三氧化二銻作用于體外培養(yǎng)的人卵巢癌細胞株SKOV3，觀察其對卵巢癌細胞株增殖和凋亡的影響，初步探討三氧化二銻的作用效果，為其用于卵巢癌的治療提供實驗及理論依據(jù)。 方法： 1三氧化二銻溶液的配制三氧化二銻溶于稀鹽酸中制成1.1mmol/L的貯備液，4℃閉光保存。臨用前攪拌至少30min，以含10％FBS RPM11640培養(yǎng)基分別稀釋至25～6.25μmol/L，保存三氧化二銻最多不超過3天。2細胞

4、培養(yǎng)將處于對數(shù)生長期的卵巢癌細胞株SKOV3按照相應(yīng)的濃度加入96孔板培養(yǎng)板于5％CO<,2>、97％濕度、37℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h后，設(shè)置空白對照組、高、中、低濃度組，每組加入等量培養(yǎng)液、不同濃度的三氧化二銻溶液。分別培養(yǎng)24、48、72h。3細胞形態(tài)學觀察倒置顯微鏡、Giemsa染色和透射電鏡觀察細胞形態(tài)學變化。4 DNALadder測定提取細胞DNA，用1.5％瓊脂糖凝膠電泳進一步檢測腫瘤細胞發(fā)生的DNA降解。5流式細胞分析采用

5、流式細胞儀定量分析經(jīng)不同濃度三氧化二銻作用于卵巢癌細胞的凋亡率及其細胞周期特異性和蛋白bcl-2、bax的表達情況。 結(jié)果： 1采用MTT法檢測細胞增殖抑制率，描繪生長柱狀圖可知經(jīng)不同濃度三氧化二銻處理后的SKOV3細胞生長緩慢，明顯的生長抑制，并呈作用濃度和時間依賴性。而空白對照組細胞則生長正常2細胞形態(tài)學觀察倒置相差顯微鏡觀察，對照組細胞生長良好，細胞透明，密度較大，呈復(fù)層性生長，細胞呈梭形，胞質(zhì)內(nèi)顆粒較少，細胞核隱

6、約可見。實驗組細胞密度明顯減少，細胞顆粒較多，細胞間隙模糊，飄浮細胞數(shù)量增加，存活細胞顯著減少。經(jīng)Giemsa染色后進行光鏡觀察，可見到細胞形態(tài)也出現(xiàn)明顯的改變。對照組細胞形態(tài)飽滿，細胞核染色均勻，核仁清晰可見；實驗組細胞中出現(xiàn)細胞質(zhì)濃縮，變圓，核仁染色不均，核染色質(zhì)邊聚，但未見凋亡小體。提示實驗組細胞出現(xiàn)凋亡的形態(tài)學改變。透射電鏡觀察到空白對照組和不同濃度三氧化二銻對人卵巢癌SKOV3細胞凋亡的超微結(jié)構(gòu)形態(tài)學改變分別如下：空白對照組的

7、正常腫瘤細胞形態(tài)：細胞形態(tài)呈多邊形，核質(zhì)比例失調(diào)，核大不規(guī)則，常染色質(zhì)豐富異染色質(zhì)少，核中央有一大而圓的核仁，細胞質(zhì)內(nèi)可見線粒體、粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，細胞表面的微絨毛減少；低濃度三氧化二銻實驗組的凋亡腫瘤細胞形態(tài)為細胞形態(tài)更加不規(guī)則，細胞膜皺縮，線粒體嵴部分融合或消失，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴張，有顆粒融合或脫顆?，F(xiàn)象，核膜局部向外突起，核染色質(zhì)濃縮，體積縮小，電子密度增加，邊聚于核膜下，厚薄不均，有的形成半月；中濃度三氧化二銻實驗組的凋亡腫瘤細胞形態(tài)除上

8、述表現(xiàn)外，同時出現(xiàn)核濃縮，體積縮小，電子密度增高，部分核膜破碎形成核碎片；高濃度三氧化二銻實驗組的凋亡腫瘤細胞形態(tài)為部分核膜外層溶解、消失，線粒體嵴大部分融合消失，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)脫顆?，F(xiàn)象嚴重，核碎裂呈兩大片，但未見典型的凋亡小體。提示三氧化二銻對人卵巢癌SKOV3細胞有一定的誘導凋亡作用，且隨著藥物濃度的增大，細胞凋亡的形態(tài)學改變越明顯。3細胞增殖抑制實驗采用MTT法檢測細胞增殖抑制情況。4 DNA Ladder測定提取對照組和實驗組細胞

9、DNA，經(jīng)1.5％瓊脂糖凝膠電泳顯示實驗組細胞DNA出現(xiàn)凋亡的特征性改變，即DNA呈梯度樣降解并隨作用濃度的增大，梯度樣條帶逐漸明顯。而對照組細胞未出現(xiàn)凋亡的特征性改變。5細胞凋亡率變化流式細胞儀檢測表明與對照組相比，不同濃度三氧化二銻實驗組細胞凋亡率升高明顯(P<0.01)，細胞周期的改變實驗組細胞與對照組細胞相比隨著藥物濃度的增加，G<,0>/G<,1>期和S期細胞逐漸減少(P<0.01)，而G<,2>/M期細胞逐漸增加(P<0.0

10、1)。6 bcl-2與bax蛋白表達量經(jīng)不同濃度的三氧化二銻作用48h后，bcl-2蛋白表達量減少，bax蛋白表達量增加(P<0.01)。 結(jié)論： 1三氧化二銻能抑制體外培養(yǎng)的人卵巢癌SKOV3細胞的生長，并呈時間和劑量依賴性。2三氧化二銻能誘導SKOV3細胞凋亡，誘導凋亡可能為其抑制細胞生長的機制之一。3細胞凋亡可能與下調(diào)bcl-2蛋白的表達，上調(diào)bax蛋白表達有關(guān)，這可能是其誘導SKOV3細胞凋亡的途徑之一。4本研究