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文檔簡介
1、第一部分:4-HPR聯(lián)合DDP對卵巢癌細胞株增殖抑制作用的體外實驗研究
目的:4-羥苯基維胺脂(N-4-hydroxyphenylretinode,4-HPR)是一種全反式維甲酸的衍生物,實驗研究和部分臨床實驗表明,它對各種腫瘤有化學預防和治療雙重作用;順鉑(cis-platin,DDP)是卵巢癌常用的化療藥物,但因其毒副作用及其耐藥等問題,臨床應用受到限制。本研究探討在體外環(huán)境下,4-羥苯基維胺酯(4-HPR)聯(lián)合順鉑(
2、DDP)對人卵巢癌細胞株SKOV-3增殖及凋亡的影響。
方法:4-HPR單藥,DDP單藥及4-HPR+DDP聯(lián)合用藥方式多種劑量分別干預人卵巢癌細胞株SKOV-3;MTT法檢測SKOV-細胞增殖抑制率變化;中效原理法判斷聯(lián)合用藥的相互作用;HOCHST和流式細胞單染和雙染分析凋亡細胞比例。實驗結果計量資料以均數(shù)±標準差表示。應用SPSS13.0統(tǒng)計分析軟件進行t檢驗,P<0.05被認為差異有統(tǒng)計學意義。
結果
3、:MTT檢測方法結果:
1、兩種藥物單獨使用時均具有劑量依賴性和時間依賴性。
2、DDP:藥物作用48小時,各相鄰藥物濃度組之間,只有DDP20μM與DDP10μM濃度組之間有統(tǒng)計學差異(P<0.05);藥物作用72小時,從DDP2.5μM濃度組開始均與相鄰藥物濃度組之間有統(tǒng)計學差異。
3、4-HPR:藥物作用48小時,各相鄰藥物濃度組之間,只有4-HPR20μM與4-HPR10μM濃度組之間有
4、統(tǒng)計學差異;藥物作用72小時,從4-HPR10μM至4-HPR20μM濃度組均與相鄰藥物濃度組之間有統(tǒng)計學差異。
4、兩種藥物聯(lián)合應用后,根據(jù)中效濃度的計算,除4-HPR1μM+DDP5μM在48h的聯(lián)合應用組外,在其余48h與72h的所有聯(lián)合應用組,均CI<1,即兩種藥物聯(lián)合應用產(chǎn)生了協(xié)同作用的效果。
HOECHST檢測方法:
1)DDP與4-HPR在作用SKOV-3細胞株72h后,兩種藥物單
5、獨使用時,均具有劑量依賴性。
2)DDP與4-HPR的聯(lián)合應用,根據(jù)中效濃度的計算,4-HPR5μM+DDP5μM組和4-HPR10μM+DDP5μM組均為CI<1,即兩種藥物聯(lián)合應用產(chǎn)生了協(xié)同作用的效果。
流式雙染檢測法結果:
1)DDP與4-HPR在作用SKOV-3細胞株72h后,兩種藥物單獨使用時均具有劑量依賴性。
2)DDP與4-HPR的聯(lián)合應用,根據(jù)中效濃度的計算,三組藥
6、物聯(lián)合應用組均為CI<1,即兩種藥物聯(lián)合應用產(chǎn)生了協(xié)同作用的效果。
流式單染檢測法:
1)DDP與4-HPR聯(lián)合應用組:DDP通過降低G1期細胞的比例,主要將細胞阻滯在G2期,抑制SKOV-3細胞的增殖,而4-HPR主要將細胞阻滯在S期和G2期。聯(lián)合應用兩種藥物的效果綜合了兩種藥物的單獨作用效果。
結論:SKOV-3細胞在4-HPR5μM+DDP5μM和4-HPR10μM+DDP5μM聯(lián)合作用7
7、2h后,能夠產(chǎn)生明顯的抑制增殖的作用,且作用協(xié)同,其中4-HPR的使用濃度越高,抑制效應越明顯。
第二部分:4-HPR聯(lián)合DDP對卵巢癌移植瘤增殖抑制作用的體內(nèi)實驗研究
目的:建立人卵巢癌皮下移植瘤裸鼠模型,探討4-HPR和DDP單獨應用及聯(lián)合應用對移植瘤的作用,進一步探討其作用機制。
方法:先培養(yǎng)人卵巢癌細胞株SKVO-3,用細胞懸液接種法制備荷瘤鼠模型1只;再用套管針組織塊接種法進行皮下接4
8、-HPR組種,共接種30只裸鼠;觀察成瘤情況;分組后腹腔分別給藥:(1)對照組:生理鹽水;(2)4-HPR組:8mg/kg;(3)順鉑組:3mg/kg;(4)聯(lián)合用藥組:4-HPR8mg/kg,4-HPR給藥6小時后給順鉑3mg/kg,均為腹腔注射給藥,一次注射劑量為0.2ml,每周兩次,共三周。每周測量腫瘤長、短徑,計算腫瘤體積,繪制腫瘤生長曲線,取瘤組織進行病理學檢查;免疫組織化學S-P法檢測瘤組織Caspase-3蛋白的表達;檢測
9、細胞凋亡率和細胞周期變化。
結果:用2.5×1010個/只細胞懸液接種成功制備荷瘤鼠一只,套管針皮下接種SKVO-3瘤塊后,2~3天皮丘消平,約4~5天可見微小的腫瘤結節(jié),接種成功率為100%。治療結束時測移植瘤體積分別為4937.72±563.28mm3、3726.34±462.32mm3、2687.78±631.91mm3、1532.69±723.84mm3,抑瘤率分別為0.00%、30.21%、42.78%、61.3
10、7%。移植瘤體積,各處理組均小于對照組,聯(lián)合用藥組小于單藥組,差異均有統(tǒng)計學意義(p<0.05);腫瘤組織病理:剖視腫瘤,對照組大部分呈類圓形,有的腫瘤可見表面血管,顏色灰白,質地較硬。光鏡下見,對照組腫瘤具有惡性腫瘤細胞的一般特性,還具有特征性的腺腔樣結構。實驗組見不同程度點、片狀壞死,并有炎性細胞的浸潤,以聯(lián)合用藥組最重。免疫組織化學法檢測Caspase-3的變化,對照組、4-HPR組、順鉑組、聯(lián)合用藥組,結果用免疫組化評分(HIS
11、)分別為:2.78±1.33、4.15±0.76、5.22±0.62、6.37±1.25,各組與對照組相比,聯(lián)合用藥組與單藥組相比,差異均有統(tǒng)計學意義(p<0.05)。流式細胞術結果顯示:對照組、4-HPR組、順鉑組、聯(lián)合用藥組,細胞凋亡率逐漸升高,分別為6.43±2.31%、14.75±4.32%、21.54±1.47%、25.76±3.42%,細胞周期G0/G1期細胞逐漸減少,G2/M期細胞逐漸增多,S期細胞變化不明顯。
12、 結論:4-HPR對SKVO-3細胞的增殖抑制作用呈時間-劑量依賴關系,4-HPR與順鉑聯(lián)合應用可增強順鉑對SKVO-3細胞的增殖抑制作用。4-HPR可抑制SKVO-3細胞裸鼠移植瘤的生長,4-HPR與順鉑聯(lián)合應用抑瘤效果增強。4-HPR可使SKVO-3細胞,細胞周期阻滯于G2/M期,誘導其凋亡,4-HPR與順鉑聯(lián)合應用誘導SKVO-3細胞凋亡作用增強。4-HPR可通過增加Caspase-3蛋白的表達,增強SKVO-3細胞對順鉑的敏感
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