中國(guó)南海新芋螺毒素基因的克隆及進(jìn)化分析.pdf

1、芋螺毒素是海洋軟體動(dòng)物芋螺分泌的一類具有神經(jīng)藥理活性的多肽，多數(shù)由12～46個(gè)氨基酸殘基組成，富含二硫鍵，且具有相對(duì)分子質(zhì)量小、結(jié)構(gòu)穩(wěn)定、活性高、選擇性強(qiáng)及易于合成等突出優(yōu)點(diǎn)。它們能特異性地作用于鈣、鈉、鉀等多種離子通道及乙酰膽堿受體、NMDA受體等多種受體亞型，已成為藥理學(xué)和神經(jīng)科學(xué)研究的探針與新藥開(kāi)發(fā)的寶庫(kù)。我國(guó)芋螺資源豐富，尚有大量芋螺毒素的種類、結(jié)構(gòu)和功能未曾得到闡明。
　　目的：本研究旨在發(fā)現(xiàn)具有獨(dú)特氨基酸序列、二硫鍵排

2、列方式的新芋螺毒素,建立和完善稀有芋螺毒素資源庫(kù)，為下一步芋螺毒素的功能研究和開(kāi)發(fā)應(yīng)用奠定堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。這將具有十分重要的理論意義和實(shí)用價(jià)值。
　　方法：以中國(guó)南海7種芋螺為研究對(duì)象，根據(jù)芋螺毒素高度保守的信號(hào)肽序列，通過(guò)3’RACE和巢式PCR的技術(shù)，從芋螺毒腺管的總RNA中克隆新毒素序列，并采用BioEdit、ClstalX1.83和Mega5.05等軟件進(jìn)行序列和進(jìn)化分析。對(duì)具有新型半胱氨酸框架的毒素進(jìn)行5’端擴(kuò)增，得到完整的

3、cDNA序列。
　　結(jié)果：
　　1、得到了60個(gè)新的毒素，涵蓋A、M、O、J等各超家族，其中A超家族2個(gè)，J超家族11個(gè)，M超家族10個(gè)，O超家族22個(gè)，其他超家族10個(gè)（S超家族2個(gè)，conomarphin家族4個(gè)，contryphan家族1個(gè)，I超家族3個(gè)），同時(shí)還發(fā)現(xiàn)了2個(gè)新的框架，將其命名為框架XXIV（2個(gè)）和XXV（3個(gè)）。
　　2、獲得了含有20個(gè)的半胱氨酸的新毒素，采用5’RACE對(duì)新毒素的5’端進(jìn)行擴(kuò)

4、增，獲得了完整的cDNA序列，這也是首次在芋螺毒素中發(fā)現(xiàn)含有20個(gè)半胱氨酸的多肽組分。
　　3、新發(fā)現(xiàn)的芋螺毒素在序列上與已報(bào)道的芋螺毒素相比差異顯著：2個(gè)α4/7型的新A超家族芋螺毒素的第二個(gè)和第三個(gè)半胱氨酸之間的V和I氨基酸很少有發(fā)現(xiàn)；在 M超家族芋螺毒素中發(fā)現(xiàn)了含有半胱氨酸數(shù)目較少或者不含半胱氨酸的新毒素；O超家族芋螺毒素的Pro區(qū)同源性小，成熟肽的氨基酸序列與已報(bào)道的有很大不同；11個(gè)新的J超家族芋螺毒素除具有 CX3CX

5、8CXC和CX3CX10CXC骨架外，還發(fā)現(xiàn)了一種新的骨架CX3CX9CXC。
　　4、對(duì)新發(fā)現(xiàn)的M、O和J超家族芋螺毒素的進(jìn)化分析表明：新的M超家族芋螺毒素分散在進(jìn)化樹的不同分支，即使是來(lái)自同種芋螺的毒素同源性很低，位于進(jìn)化樹的不同分支；O超家族芋螺毒素中，除O3家族的新毒素集中單獨(dú)位于一個(gè)小分支外，其余新毒素同源性較低，位于進(jìn)化樹的不同分支；J超家族新芋螺毒素除Di14.1和Mr14.2與已報(bào)道的芋螺毒素有同源性外，其他新毒素