Prohibitin蛋白與卵巢癌紫杉醇耐藥相關(guān)性的初步研究.pdf

1、目的:
　　 用RNA干擾技術(shù)沉默卵巢癌紫杉醇耐藥株中表達上調(diào)的Prohibitin(PHB)基因，通過MTT和流式細(xì)胞術(shù)分析沉默目的基因后靶細(xì)胞（卵巢癌紫杉醇耐藥細(xì)胞系SKOV3/Taxol-25）的細(xì)胞增殖與凋亡情況，闡明PHB為卵巢癌紫杉醇耐藥相關(guān)蛋白，為逆轉(zhuǎn)卵巢癌紫杉醇耐藥提供理論和實驗基礎(chǔ)。
　　 方法:
　　 1.在前期研究基礎(chǔ)上（采用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)比較卵巢癌紫杉醇耐藥細(xì)胞系（SKOV3/Taxol-

2、25）和敏感細(xì)胞系(SKOV3)的蛋白質(zhì)表達的差異，發(fā)現(xiàn)PHB蛋白在SKOV3/Taxol-25中表達明顯上調(diào)，提示PHB高表達可能與卵巢癌紫杉醇耐藥有關(guān)），采用Westernblot及RealTime-PCR方法驗證SKOV3/Taxol-25細(xì)胞株及SKOV3細(xì)胞株中PHB蛋白與mRNA的表達差異。
　　 2.應(yīng)用RNA干擾技術(shù)沉默PHB基因:以脂質(zhì)體Lipofectamine2000為載體，將針對靶基因PHB設(shè)計的帶有熒光

3、蛋白的三個特異性小發(fā)夾RNA干擾片段pshRNA/PHB427（實驗組PHB1）、pshRNA/PHB248（實驗組PHB2）、pshRNA/PHB136(實驗組PHB3)及pshRNA/NC（空載質(zhì)粒）瞬時轉(zhuǎn)染于卵巢癌紫杉醇耐藥細(xì)胞株(SKOV3/Taxol-25)。
　　 3.在熒光顯微鏡下定時觀察細(xì)胞熒光表達情況，在轉(zhuǎn)染48小時后，采用Westernblot及RealTime-PCR檢測PHB蛋白與mRNA水平的表達情況以

4、了解沉默效果，并篩選出沉默效果較明顯的兩個片段分別為實驗組，與陰性對照組進行后續(xù)實驗比較。
　　 4.通過MTT實驗檢測兩組細(xì)胞的增殖能力、流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞的凋亡情況。
　　 結(jié)果:
　　 1.PHB蛋白與mRNA在SKOV3/Taxol-25及SKOV3細(xì)胞株中差異表達:Western-blot結(jié)果顯示PHB蛋白在SKOV3/Taxol-25細(xì)胞株中表達高于SKOV3細(xì)胞株，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(p＜0.05);

5、RealTime-PCR結(jié)果顯示PHBmRNA在SKOV3/Taxol-25細(xì)胞株中的表達高于SKOV3細(xì)胞株，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(p＜0.05)。
　　 2.成功干擾各實驗組細(xì)胞中PHB的表達:通過瞬時轉(zhuǎn)染靶向pshRNA/PHB質(zhì)粒于SKOV3/Taxol-25細(xì)胞株，轉(zhuǎn)染后可見SKOV3/Taxol-25細(xì)胞株有綠色熒光表達，提示轉(zhuǎn)染成功，在熒光顯微鏡下觀察到轉(zhuǎn)染48h后的靶細(xì)胞綠色熒光表達最強;Western-blot結(jié)果

6、顯示三組片段均能抑制PHB蛋白的表達，其中干擾48小時后的沉默效應(yīng)最佳，以片段pshRNA/PHB427（實驗組PHB1）、pshRNA/PHB136(實驗組PHB3)干擾效果更好，兩實驗組蛋白相對表達量分別為(0.652±0.224)％、(0.598±0.026)％，與陰性對照組(pshRNA/NC)的(0.84±0.039)％相比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(p＜0.05)，而pshRNA/PHB427（實驗組PHB1）、pshRNA/PH

7、B248（實驗組PHB2）及pshRNA/PHB136(實驗組PHB3)各實驗組之間進行兩兩比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(p＞0.05)，選擇干擾效應(yīng)較好的片段pshRNA/PHB427（實驗組PHB1）及pshRNA/PHB136(實驗組PHB3)進行后續(xù)實驗;RealTime-PCR結(jié)果顯示:將片段pshRNA/PHB4.27（實驗組PHB1）、pshRNA/PHB136(實驗組PHB3)分別轉(zhuǎn)染目的細(xì)胞干擾48h后，實驗組PHB1（ps

8、hRNA/PHB427）、實驗組PHB3(pshRNA/PHB136)與陰性對照組(pshRNA/NC)的（2-ΔΔCt）之間進行比較，各實驗組的PHBmRNA相對表達量較陰性對照組有明顯下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(p＜0.05)，而實驗組PHB1(pshRNA/PHB427)與實驗組PHB3(pshRNA/PHB136)之間進行比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(p＞0.05)。
　　 3.PHB對細(xì)胞增殖及凋亡能力的影響:分別在干擾后0h、

9、24h、48h、72h及96h后進行MTT法檢測SKOV3/Taxol-25細(xì)胞株的增殖能力變化，結(jié)果顯示實驗組PHB1（pshRNA/PHB427）及實驗組PHB3(pshRNA/PHB136)的細(xì)胞增殖明顯減慢，且差異有統(tǒng)計學(xué)意義(p＜0.05);流式細(xì)胞術(shù)檢測發(fā)現(xiàn)，在RNA干擾沉默SKOV3/Taxol-25細(xì)胞株中PHB基因后，各實驗組的凋亡細(xì)胞明顯增加，同陰性對照組比較有統(tǒng)計學(xué)意義(p＜0.05)，實驗組PHB1(pshRNA

10、/PHB427)與實驗組PHB3(pshRNA/PHB136)之間的凋亡率進行比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(p＞0.05)。
　　 結(jié)論:
　　 針對PHB合成的shRNA能夠有效地抑制卵巢癌紫杉醇耐藥細(xì)胞株（SKOVS/Taxol-25）中PHB基因在蛋白和mRNA水平的表達，沉默后的SKOVS/Taxol-25細(xì)胞株的細(xì)胞增殖能力下降、細(xì)胞凋亡增加，提示PHB與卵巢癌紫杉醇耐藥產(chǎn)生相關(guān);干擾PHB的表達可能降低卵巢癌紫杉醇