轉(zhuǎn)導HER2基因啟動子控制的HSV-TK基因?qū)β殉舶┘毎禺愋詺饔玫难芯?pdf

1、中國醫(yī)科大學博士學位論文轉(zhuǎn)導HER2基因啟動子控制的HSVTK基因?qū)β殉舶┘毎禺愋詺饔玫难芯啃彰亨嶆f申請學位級別：博士專業(yè)：遺傳學指導教師：孫開來2000.3.1(HSVITK基因，又稱自殺基因，其產(chǎn)物本身沒有殺傷細胞的功能，但是在加入同樣無毒性的藥物前體GCV或ACV后，HSV—TK可在細胞內(nèi)特異地催化GCV或ACV的磷酸化反應，生成單核苷酸類似物，后者經(jīng)哺乳動物細胞內(nèi)的TK進一步催化進行二磷酸化和三磷酸化。三磷酸化的GCV

2、可抑制DNA聚合酶活性，終止DNA鏈的延長，殺死腫瘤細胞另外TK基因的旁觀者效應在一定程度上彌補了當前基因轉(zhuǎn)移效率低的不足：不但表達TK基因的細胞可被殺死，其周圍沒有表達TK的腫瘤細胞也可因細胞間縫隙連接的交流，胞吞作用或免疫反應而被殺傷。；二GFP(綠色熒光蛋白)是在水母體內(nèi)存在的一種能在長波紫外光或藍光的激發(fā)下發(fā)出綠色熒光的蛋白質(zhì)。本研究中使用的突變型GFP是在生色基團處的65位氨基酸進行改造的S65TGFP。它在普通日光照射下即可

3、發(fā)出綠色熒光，無須任何底物和化學反應，是一種使用非常方便的報告基因[21I。先以S65TGFP與HER2啟動子構(gòu)成嵌合基因，如果HER2啟動子可在HER2高表達的卵巢癌細胞系中控制GFP特異性表達，再進行TK基因治療的試驗，以保證工作的可行性。材料和方法：質(zhì)粒：PuHER2、PH8V106、P865TGFP、PLxSN。細胞系：PT67、NIH3T3、SKOV一3、MCF7。菌株：DH5Q工具酶：T4連接酶、牛腸堿性磷酸酶、限制性內(nèi)切酶

4、、AlkPhosDirect堿磷酶標記試劑盒。其它生化試劑：Fugene6、DMEM、G418、Trizol、GCV、Zeta—Probe陽離子尼龍膜。1PCR法獲得兩端帶有酶切位點的HER2基因啟動子片段。設計引物時在特異性序列5’端分別加上EcoRI和BamHI識別序列。擴增條件：94。C，5min一(94。C，lmin一57。C。linin972。Clmin)X3572。C，10min2PCR產(chǎn)物經(jīng)EcoRI和BamⅡ酶切后與同樣