特異性的HER-2 siRNA對卵巢癌細胞作用的研究.pdf

1、卵巢原發(fā)性惡性腫瘤中，60％～90％是上皮性癌，卵巢上皮性癌(卵巢癌)是病死率最高的婦科惡性腫瘤，盡管隨著手術技巧的提高可以做到最大限度的腫瘤細胞減滅術，且鉑類、紫杉醇類以及二線化學藥物治療(化療)的臨床應用給患者帶來多重生機，但是卵巢癌因臨床癥狀隱匿，診斷時超過70％的患者已屬晚期，相當一部分患者在手術和化療后仍會出現(xiàn)疾病進展或者復發(fā)，5年生存率不到30％。表皮生長因子受體-2(HER-2)原癌基因編碼—185kD具有酪氨酸激酶活性的

2、跨膜糖蛋白，在卵巢癌中多伴隨過度表達，并與患者的不良預后及對各種治療的抗性有關。在人類，HER-2多通過野生型基因的擴增和過表達激活，之后，通過一定的信號轉(zhuǎn)導通路最終影響細胞的增殖、分化、遷移、黏附、轉(zhuǎn)化、存活、凋亡，使得細胞增殖加快、細胞周期加速、惡性表現(xiàn)增強，并出現(xiàn)抗凋亡現(xiàn)象。若能把HER-2的信號功能敲除就能消弱和減少惡性細胞的生長。RNA干擾(RNAinterference，RNAi)是近年來發(fā)現(xiàn)的，由與靶基因序列同源的雙鏈RN

3、A(double-strandedRNA，dsRNA)介導的廣泛存在于生物體內(nèi)的序列特異性基因轉(zhuǎn)錄后的沉默過程。RNAi實驗時，靶位點的設計是RNAi成功的關鍵。目前，RNAi的實施方法有五種，化學合成21-23bp的小干擾RNA(smallintefferingRNA，siRNA)雖然能有效降低靶基因的表達，但合成費用昂貴而限制了其廣泛應用；載體介導的RNAi適合特異性靶位點選出后的研究，用于靶位點的篩選比較繁瑣；雞尾酒法和siRNA

4、表達框這兩種方法也不適合基因靶位點的篩選。因此我們采用T7RNA體外轉(zhuǎn)錄以獲取siRNA。第一部分：癌基因HER-2RNAi的靶位點的篩選及鑒定；第二部分：觀察抑制人卵巢癌細胞株SKOV-3細胞HER-2的表達后，其對卵巢癌細胞系SKOV-3生物學特性的影響；第三部分：觀察其對卵巢癌順鉑敏感性的影響，為卵巢癌基因治療提供一定的理論依據(jù)，為卵巢癌的化療耐藥提供新策略。 實驗材料及方法： 第一部分：首先選用已知的干擾GAPD

5、H的特異性靶位點作為陽性對照，采用脂質(zhì)體法瞬時轉(zhuǎn)染SKOV-3細胞，采用WesternBlot的方法檢測GAPDH蛋白的表達，驗證體外轉(zhuǎn)錄體系的可行性。然后在HER-2基因的編碼區(qū)內(nèi)根據(jù)靶位點的設計原則，選擇三段靶序列，體外轉(zhuǎn)錄合成HER-2siRNA，轉(zhuǎn)染人SKOV-3細胞，用Real-timePCR和Westernblot鑒定三個靶位點對HER-2基因mRNA和蛋白的干擾效果。 第二部分：采用MTF檢測細胞增殖能力的改變；A

6、nnexin-V檢測細胞凋亡率的變化，TUNEL檢測細胞凋亡的形態(tài)學改變；Transwell和細胞趨化運動實驗檢測細胞體外侵襲和趨化運動能力的改變；WesternBlot檢測參與HER-2信號轉(zhuǎn)導通路相關分子如c-fos、c-jun、NF-κB等蛋白的表達。 第三部分：采用MTT和Annexin-V的方法檢測順鉑聯(lián)合特異性HER-2siRNA對卵巢癌細胞增殖及凋亡的影響；Westernblot檢測凋亡相關蛋白的表達。 結(jié)

7、果： 第一部分：WesternBlot結(jié)果顯示GAPDHsiRNA能明顯抑制細胞內(nèi)源性GAPDH蛋白的表達，并隨著siRNA劑量的增加，GAPDH蛋白的表達逐漸降低。這說明我們建立的體外轉(zhuǎn)錄體系是可行的，然后我們又進一步優(yōu)化了此體系的各項實驗參數(shù)，建立了完善的T7體外轉(zhuǎn)錄體系。結(jié)果顯示其中siRNAⅢ可顯著降低HER-2基因表達。我們把這個特異性的siRNAⅢ轉(zhuǎn)染卵巢癌細胞系，發(fā)現(xiàn)其可顯著降低HER-2mRNA的表達，并呈時間及

8、劑量依賴性。因此后續(xù)實驗選擇HER-2siRNAⅢ轉(zhuǎn)染卵巢癌細胞作為特異性干涉組。 第二部分：(1)RNA干涉HER-2后，能顯著抑制細胞增殖，特異性干涉組細胞的增殖速率明顯低于非特異性干涉組及空白對照組(P＜0.05)。(2)采用流式細胞儀檢測干涉HER-2后SKOV-3凋亡情況。發(fā)現(xiàn)隨著HER-2mRNA表達下降，細胞凋亡增加，干涉后第6天凋亡率最高，達(53.16±0.963)％，空白對照組為(4.07±0.315)％，而

9、隨著HER-2表達恢復，凋亡率下降至干涉前水平。特異性干涉組與非特異性干涉組、空白對照組相比，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.001)，非特異性干涉組與空白對照組之間差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。(3)TUNEL結(jié)果顯示特異性干涉組細胞出現(xiàn)細胞胞質(zhì)濃縮，胞核濃聚致密的斑點狀，大小不一，形成凋亡小體，進一步從形態(tài)學上證實了凋亡的產(chǎn)生。特異性干涉組細胞的凋亡指數(shù)顯著高于非特異性干涉組及空白對照組(P＜0.001)。(4)HER-2siRNA抑

10、制卵巢癌HER-2表達后，下調(diào)c-fos，c-jun及NF-κB基因，上調(diào)P53基因，對HER-2參與的信號轉(zhuǎn)導途徑起到了調(diào)節(jié)作用。(5)HER-2siRNA抑制卵巢癌HER-2表達后，細胞的侵襲和趨化運動能力顯著減弱。 第三部分：(1)MTT分析結(jié)果顯示，三組細胞在暴露于順鉑24h后，各組細胞的存活率均隨順鉑濃度的增加而降低，但降低的幅度不同，其中，轉(zhuǎn)染HER-2siRNA組細胞的存活率降低最為顯著。在給予1μg/mL順鉑后，

11、轉(zhuǎn)染HER-2siRNA組細胞存活率(58.13±4.67)％與轉(zhuǎn)染非特異性siRNA組(65.28±5.73)％、空白對照組(68.46±2.83)％相比，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.001)，而非特異性組與空白對照組之間差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。(2)HER-2siRNA聯(lián)合順鉑后細胞的凋亡率明顯增加，與單獨使用順鉑及單獨使用HER-2siRNA組相比，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.001)。在HER-2siRNA聯(lián)合順鉑組中抗凋

12、亡蛋白Bcl-2、Survivin、XIAP明顯低于順鉑組；促進凋亡的蛋白Smac明顯高于順鉑組，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。 結(jié)論： 第一部分：(1)建立RNAi體外轉(zhuǎn)錄體系，選用干擾GAPDH特異性靶位點，并在卵巢癌細胞中驗證此體系可行，優(yōu)化和完善了各項實驗參數(shù)。應用此系統(tǒng)，使對靶基因RNAi特異性靶位點的篩選變得簡單易行。(2)應用T7體外轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)對卵巢癌癌基因HER-2特異性靶位點進行篩選，得到一個可使HE

13、R-2基因表達下降70％以上的特異性靶位點，這使我們對癌基因HER-2的反向遺傳研究提供了前提基礎。 第二部分：1.HER-2siRNA能顯著抑制細胞增殖和誘導細胞凋亡，與c-fos、c-jun、P53及NF-κB參與細胞增殖和凋亡的信號轉(zhuǎn)導通路有關。 2.HER-2siRNA能顯著抑制細胞侵襲和趨化運動能力。 第三部分：1.HER-2siRNA能增加卵巢癌SKOV-3細胞對順鉑的敏感性，顯著誘導凋亡。HER-2