不同果實特異性啟動子調(diào)控下的IGF-1基因?qū)Ψ堰z傳轉(zhuǎn)化的研究.pdf

1、番茄（Lycopersicon esculentum Mill.）是茄科（Solanaceae），番茄屬的植物，是原產(chǎn)自南美亞熱帶地區(qū)，一年生植物，是世界各地廣泛種植的一種重要蔬菜作物之一。在番茄上開展表達口服疫苗的研究，可大大提升番茄的應(yīng)用價值。不同類型的果實特異性啟動子在果實中的發(fā)育時期及調(diào)控機理不同，篩選理想的果實特異性啟動子可為利用番茄作為載體來表達外源蛋白奠定前期基礎(chǔ)。IGF-1是調(diào)節(jié)機體生長發(fā)育、生殖、免疫和機體代謝的關(guān)鍵因

2、子，在治療糖尿病、骨質(zhì)疏松、肌營養(yǎng)不良性側(cè)索硬化病等疾病具有廣闊的應(yīng)用前景。本研究以番茄為材料，構(gòu)建了包含不同果實特異性的5個啟動子表達載體，采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法，將IGF-1基因?qū)敕阎校⑦M行了分子檢測，獲得了轉(zhuǎn)基因番茄植株，為利用番茄特異表達外源蛋白提供技術(shù)和理論基礎(chǔ)，也為利用番茄口服治療糖尿病奠定材料基礎(chǔ)。具體研究結(jié)果如下：
　?。?）表達載體的構(gòu)建：本研究構(gòu)建了5個果實特異性啟動子的植物表達載體：pCAP-IGF-1、pC

3、APG-IGF-1、pCAGP-IGF-1、pCATP-IGF-1和pCAOC-IGF-1。并將5個植物表達載體導(dǎo)入農(nóng)桿菌LBA4404菌株中。
　　（2）番茄遺傳轉(zhuǎn)化體系的優(yōu)化：試驗采用AC++和1448兩種番茄材料，分別進行再生體系的培養(yǎng)，結(jié)果表明：番茄材料 AC++誘導(dǎo)分化的效果明顯高于1448，進而確立了最佳再生體系培養(yǎng)的材料為番茄材料AC++。采用正交設(shè)計法，研究了不同的激素水平（IAA、ZT、AgNO3)對番茄再生體系

4、的影響。確定了誘導(dǎo)愈傷組織及不定芽分化的最適宜培養(yǎng)基為：MS+ ZT2.0mg/L+ IAA0.5mg/L+AgNO33.0mg/l；誘導(dǎo)生根的最適宜培養(yǎng)基為：1/2 MS+IAA0.3mg/L。采用正交設(shè)計法，對影響轉(zhuǎn)化效率的各參數(shù)（浸染液、乙酰丁香酮、浸染時間、共培養(yǎng)天數(shù)）進行優(yōu)化,確定了最適宜的轉(zhuǎn)化參數(shù)：以浸染液為 MS的液體培養(yǎng)基，不添加乙酰丁香酮、浸染時間10 min、共培養(yǎng)天數(shù)2d為最佳轉(zhuǎn)化條件。
　?。?）抗性植株的

5、PCR鑒定：經(jīng)轉(zhuǎn)化體系的培養(yǎng)，最終獲得抗性苗共41株，其中AGPL1啟動子獲得抗性植株15株，黃瓜素啟動子獲得抗性植株12株，甜瓜ACO啟動子獲得抗性植株6株，PG啟動子獲得抗性植株6株，AP啟動子獲得2株抗性植株。對獲得的抗性植株進行PCR分子檢測，共21株陽性植株，陽性率達51.21％。證明外源基因IGF-1已成功整合進入番茄基因組中。其中AGPL1啟動子最終獲得陽性植株8株，黃瓜素啟動子獲得陽性植株6株，甜瓜ACO啟動子獲得陽性植