MiR-218下調Slit2-Robo1通路抑制膠質瘤細胞增殖、侵襲和遷移的機制研究.pdf

1、第一部分人腦膠質瘤中miR-218和Robo1的表達及意義
　　目的：探討人腦膠質瘤miR-218和Robo1的表達及意義。
　　方法：應用實時熒光定量PCR(qRT-PCR)檢測膠質瘤組織Ⅰ和Ⅱ級10例、Ⅲ、Ⅳ級膠質瘤組織各10例和行內減壓的正常腦組織10例的miR-218表達,Western blot和免疫組織化學法檢測Slit2和Robo1蛋白的表達水平,分析miR-218與Slit2-Robo1通路的相關性。

2、　　結果：相對于正常腦組織,RT-PCR結果提示miR-218在Ⅰ、Ⅱ級膠質瘤組織中表達減少(P<0.05),在Ⅲ、Ⅳ級膠質瘤組織中表達明顯減少(P<0.01);Slit2在正常腦神經元中顯著表達,而在膠質瘤組織中表達水平降低,并且隨著腫瘤惡性程度的增高,其表達依次降低。然而Robo1的表達與之相反,其不僅在正常腦神經元中有表達,在各級膠質瘤組織都表達增高。
　　結論：膠質瘤組織中miR-218表達明顯減少,Slit2在膠質瘤組織

3、中表達同樣減少,與miR-218表達呈正相關,Robo1在膠質瘤組織中表達異常增加,與miR-218表達呈負相關,三者的表達水平對評價膠質瘤良惡性程度有重要參考價值。
　　第二部分miR-218通過下調Slit2-Robo1通路抑制U251的細胞增殖、侵襲和遷移
　　目的：研究上調人腦膠質瘤系U251中miR-218的表達對Slit2-Robo1通路的影響及可能的機制。
　　方法：將miR-218的類似物mimics(

4、miR-218 mimics)或NC的類似物mimics(mimics NC)瞬時轉染U251細胞,設一組不做任何轉染的空白對照,qRT-PCR和Western blot分別檢測miR-218的預測靶基因Slit2-mRNA、Robo1–mRNA和蛋白表達水平。應用MTT法檢測細胞生長情況,流式細胞儀檢測細胞周期分布變化,動物實驗評價體內條件下腫瘤生長能力變化,應用Transwell小室體外侵襲和遷徙實驗檢測轉染后細胞的體外侵襲和遷移能

5、力改變。應用雙熒光素酶分析方法鑒定miR-218和Robo1 3'UTR的表達調節(jié)關系。
　　結果：U251細胞中轉染miR-218 mimics成功后miR-218表達增加;Slit2在膠質瘤細胞中同樣表達增加,而Robo1表達顯著下降。miR-218顯著減弱U251增殖能力,流式細胞周期檢測提示U251出現(xiàn)了G0/G1期阻滯,動物實驗反應體內條件下腫瘤生長能力顯著減弱。Transwell實驗提示miR-218抑制U251膠質瘤

6、細胞的體外侵襲及遷移能力。雙熒光素酶報告基因實驗提示miR-218通過直接與Robo1 mRNA 3'UTR結合負調節(jié)其表達。
　　結論：miR-218表達可下調Slit2-Robo1通路抑制U251細胞增殖、侵襲及遷移能力;miR-218的生物效應可能與調節(jié)潛在靶基因Robo1有關。
　　第三部分miR-218通過調節(jié)Robo1基因抑制U251細胞增殖、侵襲和遷移
　　目的：探討miR-218通過調節(jié)Robo1基因抑

7、制U251細胞增殖、侵襲和轉移的作用機制。
　　方法：用siRobo1下調Robo1在U251中的表達,實驗分四組：
　　①空白對照組;
　?、趍iR-218 mimics組;
　　③Robo1 siCont組;
　?、躌obo1 siRNA組。
　　Western blot分別檢測miR-218的預測靶基因Robo1蛋白表達水平。應用MTT法檢測細胞生長情況,流式細胞儀檢測細胞周期分布變化,應用Tr

8、answell小室體外侵襲和遷徙實驗檢測轉染后細胞的體外侵襲和遷移能力改變。
　　結果：與空白對照組和Robo1 siCont組比較miR-218 mimics和Robo1 siRNA組Robo1蛋白表達水平顯著下降(P<0.01),Robo1 siRNA組與miR-218 mimics組Robo1蛋白表達水平相當,無顯著差異(P>0.05)。MTT結果提示Robo1 siRNA組和miR-218 mimics組U251增殖能力顯

9、著減弱,流式細胞周期檢測提示Robo1 siRNA組和miR-218 mimics組U251出現(xiàn)了G0/G1期阻滯。Transwell實驗提示Robo1 siRNA組和miR-218 mimics組顯著抑制U251體外侵襲及遷移。下調Robo1的表達引起U251的細胞增殖抑制、細胞周期G0/G1期阻滯和體外侵襲及遷移效應與上調miR-218在U251細胞的表達引起的效應類似,且效果相當。
　　結論：miR-218通過對其下游靶基因