內(nèi)源性FOXP3抑制膠質(zhì)瘤細胞增殖遷移和侵襲.pdf

1、背景:轉錄因子FOXP3（Transcription factor forkhead box P3）是調(diào)節(jié)性T細胞（Regulatory T cells，Tregs）的特異性因子，在Tregs的發(fā)育和功能發(fā)揮中起重要作用。最近的研究發(fā)現(xiàn)FOXP3也在某些上皮細胞和腫瘤細胞中表達。本課題組前期的研究發(fā)現(xiàn)神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞中存在FOXP3的表達，然而FOXP3在神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞中的確切功能和分子機制仍不清楚。
　　目的：探討FOXP3對人神

2、經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞株U87、LN229增殖、凋亡、遷移和侵襲等生物學行為的影響，闡明FOXP3在膠質(zhì)瘤細胞中的功能作用，進一步加深對膠質(zhì)瘤發(fā)生發(fā)展的相關分子及分子基礎的理解。
　　方法：用脂質(zhì)體法將4個含有靶向FOXP3的shRNA序列（命名為shRNA1~4）和1個含有shRNA無意義陰性對照序列（Scrambled）的質(zhì)粒以及過表達FOXP3的質(zhì)粒（pCMV6-FOXP3-GFP）和其空載對照質(zhì)粒（pCMV6-Empty-GFP）轉

3、染入人膠質(zhì)瘤U87細胞和LN229細胞，并在倒置熒光顯微鏡下觀察轉染效率；應用Western blot法檢測轉染后FOXP3蛋白的表達情況，并篩選出最有效的一個shRNA干擾質(zhì)粒；應用CCK-8法檢測轉染后U87細胞和LN229細胞增殖活性的變化；應用流式細胞術（FCM）定量測定轉染后細胞的細胞周期和細胞凋亡的變化；應用Western blot法分別檢測轉染前后細胞凋亡相關蛋白caspases-3和caspases-7的表達情況；轉染質(zhì)

4、粒后細胞的遷移和侵襲情況采用細胞遷移和侵襲實驗方法進行檢測。利用SPSS17.0軟件對實驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。
　　結果：
　　1、轉染后的細胞表達熒光，放在倒置熒光顯微鏡下觀察轉染效率為80％，符合轉染的實驗要求，細胞轉染72h后熒光表達效率最高，轉染效果最好。
　　2、Western blot結果顯示轉染干擾質(zhì)粒后空白對照組(Control)、shRNA-1、shRNA-2、shRN

5、A-3、shRNA-4組和Scrambled組中FOXP3蛋白的表達受抑制最明顯的是shRNA-1組；轉染過表達質(zhì)粒后細胞FOXP3蛋白表達水平明顯上調(diào)（P<0.05）。
　　3、CCK-8結果顯示，下調(diào)FOXP3后U87細胞和LN229細胞增殖活性與對照組相比均顯著升高；上調(diào) FOXP3后細胞增殖活性與對照組相比則顯著降低（P<0.05）。
　　4、流式細胞術結果顯示，下調(diào)FOXP3后U87細胞和LN229細胞凋亡率與對照

6、組相比顯著降低；上調(diào)FOXP3后細胞凋亡率與對照組比較均顯著升高（P<0.05）。
　　5、Western blot法分別檢測轉染前后細胞凋亡相關蛋白caspases-3和 caspases-7表達情況結果顯示，上調(diào)FOXP3后細胞凋亡蛋白caspases-3和 caspases-7表達明顯升高，而下調(diào) FOXP3后 caspases-3和 caspases-7蛋白的表達則明顯降低（P<0.05）。
　　6、PI染色流式細胞

7、周期檢測分析顯示，上調(diào)FOXP3表達可以誘導U87、LN229細胞G0/G1期比例升高，S期比例降低，細胞周期阻滯在G0/G1期；下調(diào)FOXP3細胞周期沒有顯著變化（P<0.05）。
　　7、Transwell小室細胞遷移、侵襲實驗結果顯示，下調(diào)FOXP3后U87細胞和LN229細胞遷移和侵襲能力與對照組相比顯著升高；上調(diào)FOXP3后細胞遷移和侵襲能力則顯著降低（P<0.05）。
　　結論：
　　1、轉錄因子FOXP3

8、在膠質(zhì)瘤細胞株U87、LN229中具有抑制腫瘤細胞增殖的作用。
　　2、轉錄因子 FOXP3在膠質(zhì)瘤細胞株 U87、LN229中可能通過影響凋亡蛋白caspases-3和 caspases-7表達促進腫瘤細胞凋亡。
　　3、上調(diào)膠質(zhì)瘤細胞FOXP3的表達可以誘導U87、LN229細胞發(fā)生細胞周期阻滯，使U87、LN229細胞周期阻滯在G0/G1期，可能成為膠質(zhì)瘤基因靶向治療的新策略。
　　4、FOXP3抑制U87細胞和